【摘 要】
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本文以山羊痘病毒为载体，利用病毒在细胞内的同源重组，以绿色荧光蛋白为筛选标记，探索FMDV P1-2A、3C在细胞中的表达，使得进一步预测它们的生物学特征、应用前景及构建更多的表达
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本文以山羊痘病毒为载体，利用病毒在细胞内的同源重组，以绿色荧光蛋白为筛选标记，探索FMDV P1-2A、3C在细胞中的表达，使得进一步预测它们的生物学特征、应用前景及构建更多的表达外源基因的重组GPV变得实际可行。主要的工作进行如下：
1．目的基因的获得：提取山羊痘病毒温度敏感弱毒株(YD)DNA为模板，设计特异性引物并进行PCR扩增，获得了2078bp的DNA片段，并将PCR产物克隆至pGEM-Teasy载体。酶切鉴定、PCR鉴定和测序结果表明，成功获得了TK基因，获得的TK基因内存在一个Kpn I酶切位点和编码区的早期转录终止信号TTTTTN(T)T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明，弱毒毒株YDTK基因与参考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性在95.5％-100.0％之间，说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。
2．转移载体的构建：为了在重组GPV中真实高效地表达外源基因，将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因与启动绿色荧光蛋白双向串连痘苗病毒启动子相连，为进一步构建用于转染的转移质粒载体提供了包含真核基因表达元件和筛选标记基因的表达盒。以kpn， I为插入位点，将整体表达盒插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中，构建共表达重组山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-GFP-P。
3．重组山羊痘病毒的筛选和鉴定：在构建表达Asia I型FMDV P1-2A和3C基因和含有绿色荧光蛋白基因的重组山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-GFP-P的基础上，采用脂质体转染山羊痘病毒感染的BHK-21细胞后，进行了多次传代培养，经绿色荧光筛选，RT-PCR检测，夹心ELISA成功获得能正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株vTK-3CP1-GFP。本研究为FMD侯选疫苗的制备、最终有效控制FMD奠定基础。
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