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鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白3（E.tenella microneme protein 3,Et MIC3）是E.tenella的微线体在球虫入侵宿主细胞早期阶段中分泌于子孢子表面的重要蛋白质,且能够与鸡盲肠上皮细胞表面的特定受体分子结合从而介导整个入侵过程。由E.tenella引起的球虫病对养禽业的危害非常大。由于当前主要的治疗（抗球虫药）和预防（球虫活苗）球虫疾病的方法存在易产生耐药性以及花费成本高等缺点,因此有研究基于其入侵机制进行抗球虫疾病的研究,并发现Et MIC3可作为候选疫苗有效降低球虫的入侵程度。Et MIC3由七个串联重复结构域组成（A、B、C1、C2、C3、C4、D）,包括两端三个不完全重复结构域和中间四个完全重复结构域（C1、C2、C3、C4段）,在对各个区域进行保守性及抗原性分析之后,本研究主要探讨了B段和C1段（Et MIC3-BC1）两个片段在虫体入侵宿主细胞过程中所起到的作用。噬菌体展示技术是一种新的技术,可以用来鉴别抗原表位及研究抗原和抗体的结构,并且能够筛选出抗原和抗体的模拟肽,在寄生虫病研究及防治中具有重要作用。本实验通过采用噬菌体展示技术获得了能与Et MIC3-BC1蛋白特异结合的亲和肽,并研究了目的亲和肽在体内、外抑制虫体入侵宿主细胞的作用。1、原核表达Et MIC3-BC1蛋白并制备相应多克隆抗体。本实验首先进行了重组表达质粒的构建（p ET-30a-Et MIC3-BC1）,并通过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂的诱导将目的蛋白表达于E.coli（BL21）中。该重组蛋白在经SDS-PAGE验证之后,大量纯化回收,并且进行蛋白质复性。以复性之后的蛋白作为免疫原对新西兰大白兔进行免疫,从而制备多克隆抗体,通过Western blot（WB）和ELISA方法对抗体进行检测。琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE的实验结果显示了在本实验中p ET-30a-Et MIC3-BC1重组表达质粒被成功构建以及重组蛋白的成功表达;WB和ELISA结果说明了以Et MIC3-BC1蛋白作为抗原能够制备生物学活性（BA）良好的多克隆抗体。2、Et MIC3-BC1重组蛋白亲和肽的筛选。按照试剂盒说明,通过噬菌体展示技术,以纯化并且复性之后的重组Et MIC3-BC1蛋白为靶分子于噬菌体十二肽库中进行四轮生物筛选,并在第四轮生物筛选结束后随机地选择三十个状态良好的噬菌斑进行噬菌体扩增、提DNA、测序并推导出其氨基酸序列。结果显示,30个独立的噬菌斑共得到8种亲和力较高的十二肽序列,合成了其中出现频率及亲和力较高的A肽（AGRLLTPTMSLV）、D肽（DYHDPSLPTLGK）、W肽（WKDVHKAWLLEP）进行进一步研究。并且通过ELISA、间接ELISA和竞争ELISA法表明这三种多肽对应的噬菌体能够与Et MIC3-BC1和子孢子蛋白发生特异性结合以及抗Et MIC3-BC1多抗可以抑制噬菌体与重组蛋白之间的结合。3、测定A肽、D肽、W肽体外抵抗E.tenella子孢子入侵MDBK细胞的水平。采用MTT法测得这三种亲和肽作用于MDBK细胞的最大无毒浓度是125μg/ml。通过Percoll密度梯度离心法进行E.tenella子孢子的纯化,并且采用CFDA-SE荧光探针对子孢子进行标记。通过流式细胞仪检测当三种多肽浓度分别为25μg/m L,50μg/m L,75μg/m L,100μg/m L,125μg/m L时抑制子孢子（30万/孔）入侵MDBK细胞（1万/孔）的效率。结果显示这三种多肽都能够抑制子孢子的入侵,并且A肽、D肽的抑制效果都极显著高于W肽（P<0.01）,A肽的抑制效果极显著高于D肽（P<0.01）。4、检测A肽、D肽、W肽相应噬菌体在机体内的抗球虫作用。75只21日龄蛋鸡随机分成五组（15只/组）:PBS组、A组、D组、W组、E.tenella感染对照组。21日龄时,PBS组的鸡口服无菌PBS,A组、D组、W组、E.tenella感染对照组的鸡口服E.tenella孢子化卵囊（1万/只）。于攻虫后的第0-2天,给PBS组与E.tenella感染对照组口服无菌PBS,A组每天口服1×1012pfu A肽所对应的阳性噬菌体、D组每天口服1×1012pfu D肽所对应的阳性噬菌体、W组每天口服1×1012pfu W肽所对应的阳性噬菌体。感染后第七天取各组粪便,观察克粪便卵囊排出减少率。于感染后的第八天对各组鸡进行剖杀,测定各组鸡的体重变化、盲肠病变评分、大体病理学和组织病理学变化、OPG和ACI等指标。结果表明,A组、D组、W组都能够抵抗一定程度的球虫感染,其中A组和D组的各项指标与攻虫对照组相比差异极显著（P<0.01）且A组优于D组,W组与E.tenella感染对照组相比较差异显著（P<0.05）。各组的抗球虫指数分别为:200（PBS组）、168.74（A组）、161.27（D组）、137.36（W组）、118.21（E.tenella感染对照组）。5、Atodock分子对接软件评估Et MIC3-BC1蛋白和三种多肽的结合方式。通过Swiss-model对Et MIC3-BC1蛋白建立三维模型,用Atodock分析A肽、D肽、W肽分别和Et MIC3-BC1蛋白在空间上的结合情况。结果显示A肽、D肽、W肽与Et MIC3-BC1蛋白之间均存在疏水作用力和氢键,且A肽的结合作用最佳,D肽次之,W肽较弱,表明三种多肽在空间上均能够与Et MIC3-BC1蛋白结合。综上,本实验用Et MIC3-BC1蛋白所筛选出的亲和配体（A肽、D肽、W肽）体内、外能够有效的抑制E.tenella子孢子对宿主细胞的入侵,具备一定的抵抗球虫感染保护作用。本研究丰富了研制基于Et MIC3的鸡球虫病相关多肽疫苗的依据。