【摘 要】
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目的:探讨肿瘤微环境响应性多模态靶向成像纳米颗粒造影剂的制备方法,并研究该纳米颗粒造影剂的乳腺癌分子靶向成像诊断应用前景,以期为肿瘤的多模态成像研究提供参考依据。方法:（1）采用双乳化法制备以PLGA为载体、具备肿瘤微环境响应性和多模态靶向成像能力的纳米颗粒造影剂,在超声、磁共振和荧光成像三种模态下分别验证本纳米颗粒造影剂的肿瘤靶向能力。理论上,PLGA颗粒经RGD多肽修饰可与乳腺癌表面高表达的整
【基金项目】
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国家自然科学基金项目,项目名称:基于整合素αvβ3受体的靶向磁共振/超声双模态造影技术评价人乳腺癌裸鼠移植瘤转移的研究,项目合同编号:81760517
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目的:探讨肿瘤微环境响应性多模态靶向成像纳米颗粒造影剂的制备方法,并研究该纳米颗粒造影剂的乳腺癌分子靶向成像诊断应用前景,以期为肿瘤的多模态成像研究提供参考依据。方法:（1）采用双乳化法制备以PLGA为载体、具备肿瘤微环境响应性和多模态靶向成像能力的纳米颗粒造影剂,在超声、磁共振和荧光成像三种模态下分别验证本纳米颗粒造影剂的肿瘤靶向能力。理论上,PLGA颗粒经RGD多肽修饰可与乳腺癌表面高表达的整合素αvβ3结合而实现肿瘤靶向性;PLGA内包裹的Na2CO3、Fe3O4和Cy5.5分别用于靶向纳米颗粒的超声、磁共振及荧光成像。（2）通过Zetasizer Nano测量纳米颗粒的粒径及电位;使用FEI Tecnai F20透射电子显微镜获得纳米颗粒的形貌;Hitachi F-7000荧光光谱仪则用于检测Cy5.5负载情况;使用傅立叶变换红外光谱仪进行近红外光谱的检测;应用振动样品磁力计确定靶向纳米颗粒和游离Fe3O4的磁滞曲线。（3）为评估本纳米颗粒的靶向特异性,将MDA-MB-231细胞分别与靶向和非靶向的纳米颗粒共孵育,使用共聚焦激光扫描显微镜探究乳腺癌细胞与纳米颗粒的结合情况,并通过流式细胞术对结合情况进行定量检测。（4）通过CCK8细胞毒性实验,将不同浓度的靶向纳米颗粒与MDA-MB-231细胞、A549细胞及MCF-7细胞孵育,研究Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD的生物相容性。（5）在琼脂糖凝胶模型中分别加入p H7.2和6.8的靶向和非靶向纳米颗粒,并使用PBS溶液作为对照,在B模式和CEUS模式下检测纳米颗粒的体外超声成像情况。（6）将不同浓度的纳米颗粒加入Eppendorf管中,使用T2加权成像对每个EP管进行T2磁共振成像。通过线性拟合计算该纳米颗粒的横向弛豫率。（7）在裸鼠皮下构建乳腺癌异种移植模型并验证Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD的体内靶向成像效果:分别通过尾静脉和皮下注射靶向纳米颗粒,使用7 MHz换能器获取注射前及注射后0、30、60、90min的肿瘤、肝脏和皮下区域超声图像。对于体内磁共振成像,将小鼠随机分为两组。第一组在皮下肌肉和肿瘤组织内局部注射靶向纳米颗粒,另一组则通过尾静脉注射,在3.0T MRI下对裸鼠行T2加权成像,成像部位同超声。体内荧光成像采用活体荧光成像系统进行,经尾静脉注射纳米颗粒后每30分钟拍摄一次图像,并持续4小时。解剖出裸鼠重要器官和肿瘤并拍摄荧光图像,并对这些重要器官进行H＆E染色以评估组织毒性。此外,用抗整合素αv和β3的抗体对冰冻的肿瘤切片进行免疫荧光染色,以验证本纳米颗粒造影剂的靶向性。结果:（1）测得纳米颗粒的平均流体动力学尺寸为117.6 nm,平均多分散指数为0.234。纳米颗粒的表面电荷为-21.7m V。荧光光谱测量表明,纳米颗粒在685nm具有最大发射波长。Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD纳米颗粒和游离Fe3O4的饱和磁化强度分别为32.6和42.5 emu/g。靶向纳米颗粒的近红外荧光光谱显示其表面的羧基与RGD多肽的氨基之间的有效偶联。（2）共聚焦显微镜结果显示,与非靶向纳米颗粒相比,靶向纳米颗粒与细胞孵育后在细胞膜上显示出明显的红色荧光;流式细胞术的结果显示靶向纳米颗粒与MDA-MB-231细胞孵育后显示出更高的荧光强度。（3）CCK8结果表明,在Fe浓度为5-80μg/m L的范围内,MDA-MB-231细胞的存活率未见明显降低,其细胞活力仍高于70%。（4）Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD纳米颗粒的体外超声对比成像显示,与p H 7.2条件相比,弱酸性p H 6.8时靶向纳米颗粒的超声对比增强更为显著。（5）对于体外磁共振成像研究,随着靶向纳米颗粒中铁浓度的增加,T2加权信号强度显着下降,横向弛豫率为19.597m M-1s-1。（6）体内超声结果显示,注射靶向纳米颗粒后30分钟开始观察到肿瘤区域有超声对比增强,并能够持续90分钟。在皮下注射区域未发现明显增强,肝脏区域的超声对比增强明显低于肿瘤,随着时间推移二者差异更明显。体内磁共振T2成像显示注射后24小时肿瘤的信号强度明显降低,并且在肝脏和肾脏中观察到T2信号降低,这表明纳米颗粒中的铁离子可以从体内快速清除。（7）对于体内荧光成像,Cy5.5荧光信号在肿瘤区域逐渐增加,并在注射后2小时达到峰值。肿瘤切片的免疫荧光染色显示,整合素αvβ3在肿瘤组织中具有高表达。H＆E染色表明,所有器官组织切片均显示正常的组织形态,并且无组织病理学损伤反应,说明该靶向纳米颗粒具有良好的生物相容性。结论:本研究成功制备了具备肿瘤微环境响应性和多模态靶向成像能力的纳米颗粒造影剂Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD。本靶向纳米颗粒造影剂在磁共振、超声和荧光成像模态下均表现出出色的乳腺癌靶向成像特性和良好的生物相容性,表明该靶向纳米颗粒造影剂在肿瘤分子靶向成像诊断中具有广阔的应用前景。
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