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目的:
败血症，又称脓毒症，是一种严重的可能危及生命的全身性炎症反应，其致病原因主要由感染或者组织损伤引起的全身性炎症应答综合征，可导致多器官组织损伤，甚至可因器官衰竭而导致死亡。败血症目前仍然是医院重症监护病房中最常见的死亡原因，败血症的预防与治疗依然是当前社会的巨大公共卫生负担。高迁移率(HMG-Box)蛋白家族是一类细胞核蛋白，具有独特的DNA结合域HMG-Box，与非B型DNA结构的亲和力高，通过弯曲，扭结和展开来扭曲DNA，具有维持染色质结构，DNA修复，转录调控，或者促进核糖体的生物合成等作用。然而，1999年研究者意外的发现HMGB1在全身性炎症反应中可以从细胞核中分泌到细胞外，并作为一种促炎细胞因子介导炎症反应。在败血症期间，阻止HMGB1的分泌或者用HMGB1特异性抗体靶向血液中HMGB1，可以显著提高致死性败血症的生存率。现有文献表明，高迁移率蛋白家族中的多个成员参与多种因素介导的炎症反应。HMGXB4是首次在哺乳动物中克隆的该家族的新成员，其是否参与炎症反应尚不清楚。本文旨在探讨Hmgxb4基因在全身性炎症诱导的败血症中的作用及其分子机制，从而为寻找治疗炎症性败血症的新靶点提供实验依据。
方法:
1.LPS刺激对小鼠巨噬细胞Hmgxb4表达的影响:1）提取WT小鼠的腹腔巨噬细胞，用不同剂量的LPS刺激巨噬细胞或者用100ng/ml LPS刺激巨噬细胞不同的时间点，提取总RNA和总蛋白通过qRT-PCR和Western blot实验检测LPS刺激巨噬细胞对Hmgxb4表达的影响;2）用免疫荧光染色法检测LPS刺激巨噬细胞诱导HMGXB4蛋白表达的细胞定位;3）细胞质与细胞核蛋白分离法进一步分析HMGXB4蛋白的细胞定位。
2.全身性敲除Hmgxb4基因小鼠及其炎症性败血症模型的建立与表型分析:1）构建全身性Hmgxb4基因敲除小鼠及其特征分析;2）利用野生型或全身性Hmgxb4基因敲除鼠制备内毒素(LPS)或多微生物感染(CLP)诱导的小鼠败血症模型，检测下述指标:a.检测小鼠的生存曲线;b.HE染色分析小鼠肺和肾组织的损伤程度;c.ELISA法分析小鼠血清促炎症细胞因子的含量;d.TUNEL法检测肺组织的细胞凋亡;e.肺组织免疫荧光染色检测肺组织中的巨噬细胞浸润情况;f.尾静脉注射EBD检测小鼠肺血管的通透性。
3.全身性敲除Hmgxb4基因对炎症所致小鼠败血症的保护作用及其机制分析:1）RNA-seq鉴定LPS刺激诱导Hmgxb4基因缺失巨噬细胞的基因差异性表达;2）结合RNA-seq和ENCODE数据库中HMGXB4ChIP-seq数据鉴定HMGXB4直接调控的潜在靶基因;3）采用qRT-PCR和Westem blot技术验证巨噬细胞缺失HMGXB4对潜在的靶基因Nos2的转录调控及其生物学功能分析;4）利用双荧光素酶报告质粒分析HMGXB4对靶基因Nos2启动子的转录调控作用;5）利用腹腔注射高剂量LPS(20mg/kg)诱导WT和Hmgxb4基因缺失小鼠的急性肺损伤模型，并用qRT-PCR和Western blot验证HMGXB4对靶基因Nos2的转录调控;6）在WT和Hmgxb4基因缺失小鼠中腹腔注射LPS诱导全身性炎症反应，用NOS2抑制剂1400W抑制NOS2活性，尾静脉注射EBD检测小鼠肺血管的通透性。
结果:
1.LPS介导的巨噬细胞激活可诱导核蛋白HMGXB4的转录与表达:1）qRT-PCR和Western blot结果显示，LPS以时间与剂量依赖性方式诱导腹腔巨噬细胞Hmgxb4拘转录与表达;2）免疫荧光染色及细胞质与细胞核蛋白分离结果显示，HMGXB4是腹腔巨噬细胞的一个核蛋白，LPS可诱导其表达，且定位在核内。
2.敲除Hmgxb4基因显著改善系统性炎症反应导致的小鼠组织损伤和致死率:1）首先构建了Hmgxb4基因全身性敲除小鼠，结果显示敲除Hmgxb4基因对小鼠的发育与繁殖没有明显的影响;2）敲除Hmgxb4基因可以显著延长LPS或多微生物感染(CLP)诱导的致死性败血症的小鼠生存时间;3）HE染色结果显示，敲除Hmgxb4基因可以明显保护LPS诱导的急性肺和肾组织损伤:4）ELISA结果显示，敲除Hmgxb4基因对经典的促炎细胞因子分泌没有影响;5）TUNEL染色结果显示，敲除Hmgxb4基因可明显减少LPS诱导小鼠急性肺损伤的细胞凋亡;6）LGALS3(Mac2)免疫荧光染色显示，敲除Hmgxb4基因显著减少LPS诱导小鼠急性肺损伤时的巨噬细胞浸润;7）EBD结果显示，敲除Hmgxb4基因可以明显保护全身性炎症诱导的肺血管通透性。
3.敲除Hmgxb4基因通过抑制IPS诱导的NOS2表达及NO产生保护LPS诱导的全身性炎症引起的肺组织损伤:1）RNA-seq结果分析显示，HMGXB4缺失可改变LPS诱导的巨噬细胞的基因表达;2）结合RNA-seq和ENCODE数据库中HMGXB4ChIP-seq数据鉴定Nos2基因是HMGXB4直接调控的一个潜在靶基因:3）qRT-PCR和Westemblot结果显示，在体外巨噬细胞中Hmgxb4基因缺失可抑制LPS诱导的Nos2基因的转录与表达，同时减少NO的产生;4）双荧光素酶报告实验结果显示HMGXB4可以反式激活Nos2基因启动子上的增强子活性，从而调控Nos2基因的转录与表达;5）qRT-PCR和Western blot结果显示，在LPS诱导的急性肺损伤组织中，Hmgxb4基因缺失可抑制LPS诱导的Nos2基因的表达，改善肺部组织炎症;6）在LPS诱导的全身性炎症反应中，注射NOS2抑制剂1400W，与Hmgxb4基因缺失类似，可以改善全身性炎症诱导的肺血管通透性。
结论:
1.LPS刺激可促进小鼠腹腔巨噬细胞的HMGXB4表达，且定位在细胞核中;HMGXB4可明显调节LPS诱导的小鼠巨噬细胞的基因表达谱;HMGXB4可与Nos2基因启动子上的增强子区域结合，并以反式激活方式调控Nos2基因的转录表达;
2.全身性敲除Hmgxb4基因对全身性炎症诱导的器官损伤及生存率具有明显的保护作用，其机制与Hmgxb4缺失抑制LPS诱导的巨噬细胞NOS2表达和NO产生有关。
败血症，又称脓毒症，是一种严重的可能危及生命的全身性炎症反应，其致病原因主要由感染或者组织损伤引起的全身性炎症应答综合征，可导致多器官组织损伤，甚至可因器官衰竭而导致死亡。败血症目前仍然是医院重症监护病房中最常见的死亡原因，败血症的预防与治疗依然是当前社会的巨大公共卫生负担。高迁移率(HMG-Box)蛋白家族是一类细胞核蛋白，具有独特的DNA结合域HMG-Box，与非B型DNA结构的亲和力高，通过弯曲，扭结和展开来扭曲DNA，具有维持染色质结构，DNA修复，转录调控，或者促进核糖体的生物合成等作用。然而，1999年研究者意外的发现HMGB1在全身性炎症反应中可以从细胞核中分泌到细胞外，并作为一种促炎细胞因子介导炎症反应。在败血症期间，阻止HMGB1的分泌或者用HMGB1特异性抗体靶向血液中HMGB1，可以显著提高致死性败血症的生存率。现有文献表明，高迁移率蛋白家族中的多个成员参与多种因素介导的炎症反应。HMGXB4是首次在哺乳动物中克隆的该家族的新成员，其是否参与炎症反应尚不清楚。本文旨在探讨Hmgxb4基因在全身性炎症诱导的败血症中的作用及其分子机制，从而为寻找治疗炎症性败血症的新靶点提供实验依据。
方法:
1.LPS刺激对小鼠巨噬细胞Hmgxb4表达的影响:1）提取WT小鼠的腹腔巨噬细胞，用不同剂量的LPS刺激巨噬细胞或者用100ng/ml LPS刺激巨噬细胞不同的时间点，提取总RNA和总蛋白通过qRT-PCR和Western blot实验检测LPS刺激巨噬细胞对Hmgxb4表达的影响;2）用免疫荧光染色法检测LPS刺激巨噬细胞诱导HMGXB4蛋白表达的细胞定位;3）细胞质与细胞核蛋白分离法进一步分析HMGXB4蛋白的细胞定位。
2.全身性敲除Hmgxb4基因小鼠及其炎症性败血症模型的建立与表型分析:1）构建全身性Hmgxb4基因敲除小鼠及其特征分析;2）利用野生型或全身性Hmgxb4基因敲除鼠制备内毒素(LPS)或多微生物感染(CLP)诱导的小鼠败血症模型，检测下述指标:a.检测小鼠的生存曲线;b.HE染色分析小鼠肺和肾组织的损伤程度;c.ELISA法分析小鼠血清促炎症细胞因子的含量;d.TUNEL法检测肺组织的细胞凋亡;e.肺组织免疫荧光染色检测肺组织中的巨噬细胞浸润情况;f.尾静脉注射EBD检测小鼠肺血管的通透性。
3.全身性敲除Hmgxb4基因对炎症所致小鼠败血症的保护作用及其机制分析:1）RNA-seq鉴定LPS刺激诱导Hmgxb4基因缺失巨噬细胞的基因差异性表达;2）结合RNA-seq和ENCODE数据库中HMGXB4ChIP-seq数据鉴定HMGXB4直接调控的潜在靶基因;3）采用qRT-PCR和Westem blot技术验证巨噬细胞缺失HMGXB4对潜在的靶基因Nos2的转录调控及其生物学功能分析;4）利用双荧光素酶报告质粒分析HMGXB4对靶基因Nos2启动子的转录调控作用;5）利用腹腔注射高剂量LPS(20mg/kg)诱导WT和Hmgxb4基因缺失小鼠的急性肺损伤模型，并用qRT-PCR和Western blot验证HMGXB4对靶基因Nos2的转录调控;6）在WT和Hmgxb4基因缺失小鼠中腹腔注射LPS诱导全身性炎症反应，用NOS2抑制剂1400W抑制NOS2活性，尾静脉注射EBD检测小鼠肺血管的通透性。
结果:
1.LPS介导的巨噬细胞激活可诱导核蛋白HMGXB4的转录与表达:1）qRT-PCR和Western blot结果显示，LPS以时间与剂量依赖性方式诱导腹腔巨噬细胞Hmgxb4拘转录与表达;2）免疫荧光染色及细胞质与细胞核蛋白分离结果显示，HMGXB4是腹腔巨噬细胞的一个核蛋白，LPS可诱导其表达，且定位在核内。
2.敲除Hmgxb4基因显著改善系统性炎症反应导致的小鼠组织损伤和致死率:1）首先构建了Hmgxb4基因全身性敲除小鼠，结果显示敲除Hmgxb4基因对小鼠的发育与繁殖没有明显的影响;2）敲除Hmgxb4基因可以显著延长LPS或多微生物感染(CLP)诱导的致死性败血症的小鼠生存时间;3）HE染色结果显示，敲除Hmgxb4基因可以明显保护LPS诱导的急性肺和肾组织损伤:4）ELISA结果显示，敲除Hmgxb4基因对经典的促炎细胞因子分泌没有影响;5）TUNEL染色结果显示，敲除Hmgxb4基因可明显减少LPS诱导小鼠急性肺损伤的细胞凋亡;6）LGALS3(Mac2)免疫荧光染色显示，敲除Hmgxb4基因显著减少LPS诱导小鼠急性肺损伤时的巨噬细胞浸润;7）EBD结果显示，敲除Hmgxb4基因可以明显保护全身性炎症诱导的肺血管通透性。
3.敲除Hmgxb4基因通过抑制IPS诱导的NOS2表达及NO产生保护LPS诱导的全身性炎症引起的肺组织损伤:1）RNA-seq结果分析显示，HMGXB4缺失可改变LPS诱导的巨噬细胞的基因表达;2）结合RNA-seq和ENCODE数据库中HMGXB4ChIP-seq数据鉴定Nos2基因是HMGXB4直接调控的一个潜在靶基因:3）qRT-PCR和Westemblot结果显示，在体外巨噬细胞中Hmgxb4基因缺失可抑制LPS诱导的Nos2基因的转录与表达，同时减少NO的产生;4）双荧光素酶报告实验结果显示HMGXB4可以反式激活Nos2基因启动子上的增强子活性，从而调控Nos2基因的转录与表达;5）qRT-PCR和Western blot结果显示，在LPS诱导的急性肺损伤组织中，Hmgxb4基因缺失可抑制LPS诱导的Nos2基因的表达，改善肺部组织炎症;6）在LPS诱导的全身性炎症反应中，注射NOS2抑制剂1400W，与Hmgxb4基因缺失类似，可以改善全身性炎症诱导的肺血管通透性。
结论:
1.LPS刺激可促进小鼠腹腔巨噬细胞的HMGXB4表达，且定位在细胞核中;HMGXB4可明显调节LPS诱导的小鼠巨噬细胞的基因表达谱;HMGXB4可与Nos2基因启动子上的增强子区域结合，并以反式激活方式调控Nos2基因的转录表达;
2.全身性敲除Hmgxb4基因对全身性炎症诱导的器官损伤及生存率具有明显的保护作用，其机制与Hmgxb4缺失抑制LPS诱导的巨噬细胞NOS2表达和NO产生有关。