[研究背景] 分离细胞特异表达基因的工作是人类基因组计划(Human Genome Projects,HGP)的重要组成部分，它不但有助于基因的染色体定位、染色体基因组的结构与功能分析，同时更重要的是为阐明细胞功能奠定了重要的基础。 全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)是最早、也是至今为止临床使用最为普遍的一种恶性肿瘤诱导分化剂，但要达到持久的抗肿瘤效应则需要与化疗联合应用。虽然早些时候，来自临床大样本的资料就已经显示受ATRA诱导后的瘤细胞对ATRA及多种化疗药物敏感性降低，但至今学术界仍对ATRA使用后是否可继发瘤细胞产生多药耐药存在争议。大多数学者的研究仅仅局限在探讨ATRA使用后所继发产生的对ATRA本身分化作用的耐受及机制，而忽视了ATRA使用后对其他化疗药物疗效的影响。近年，国外几位学者观察到ATRA使用后可继发瘤细胞产生对多种化疗药物的耐受，但考虑到ATRA本身对瘤细胞分化及细胞周期的影响，于是将ATRA使用后所继发的多药耐药产生的机制简单归咎于瘤细胞在分化诱导过程中不可避免的细胞周期G0/G1期阻滞。我们的前期研究曾观察到ATRA使用后可诱导人肝母细胞瘤细胞系HePGZ细胞多药耐药的产生，其机制可能涉及多种与多药耐药相关基因的调控，但该实验并未完全排除细胞分化、细胞周期改变及瘤细胞特异性等因素可能对实验产生的潜在影响。l研究目的l 为了排除细胞分化、细胞周期及瘤细胞特异性等因素对实验可能产生的干扰，本实验以诱导分化中最常采用的人急性髓系白血病细胞系F压一60为研究对象，采用少量、递增、多次、反复ATRA处理导致肿瘤细胞产生耐药的方法，建立一株耐ATRA分化作用的细胞系，在排除ATRA对瘤细胞细胞周期和分化状态影响的情况下，探讨ATRA是否可以导致恶性肿瘤细胞耐药的产生。若能，则进一步筛选并分离与瘤细胞耐药相关的基因，为揭示ATRA导致肿瘤耐药产生的机制及解决ATRA在恶性肿瘤诱导分化治疗中这一实际存在的继发性耐药问题提供线索。l研究方法l1.ATRA诱导白血病细胞耐分化模型的建立—采用少量、递增、多 次、反复ATRA体外培养的方法，诱导生成耐ATRA分化作用细胞 系1丑J一60/ATRA。2.HL一60/ATRA生物学特性的评估—采用MTT法、透射电镜、流 式细胞仪、PCR-ELISA及NBT还原实验对细胞的增殖、细胞形态、 细胞周期、端粒酶活性、细胞功能及对化疗药物的敏感性进行检测。3.抑制消减杂交建立包含I丑J一60价TRA与HL一60细胞系差异高表达基 因的抑制消减杂交文库重庆医科大学博士研究生学位论文4.基因芯片技术对HL一60/ATRA抑制消减杂交文库中差异表达的基因 进行高通量筛选，并初步了解这些基因在HL一60/AfRA中表达丰度。5.差异表达基因片段的序列测定及生物信息学分析【结果】1采用小量、多次、递增ATRA处理野生型11L一60细胞后，证实HL一60/AfRA细胞在较高浓度(10一7M)的AfRA中仍保持原有的细胞增殖周期及分化状态不变。同时药物敏感性实验证实HL一60/A]户RA对多种化疗药物:VCR、ADM、MMC、VP一16、DNR、CTX等均产生了不同程度的耐受，耐药倍数为3一10倍不等。2采用抑制消减杂交(SSH)建立了HL一60/ATRA抑制消减杂交文库。在进行SSH时以HL一60作为对照即“driver”，以HIJ一60/户江，RA作为实验方即“tester”，筛选HL一60/ATRA中差异表达的基因。将经过两次消减杂交及PCR扩增后的产物经“A一T clone”克隆到pUC57/T载体，进而转染大肠杆菌获得消减文库，共挑选出510个克隆，经PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200一700bp的克隆有433个，阳性率高达84.8%。3用基因芯片技术对抑制消减杂交文库进行筛选，将消减文库中通过PCR的方法所鉴定出的的433个阳性克隆的产物经过纯化后用于制备基因芯片。经过筛选挑选出ratio值大于3的克隆112个。在这112个克隆中我们随机挑选了12个在1丑习一60/ATRA呈高强度差异表达的基因克隆进行序列测定。4序列同源性分析结果:在进行测序的12个克隆中，H个为已知基因重庆医科大学博士研究生学位论文片段，1个为未知基因片段。5采用“silieon cloning，’的方法，进一步获取未知基因全长序列，获得一条含有完整编码框、长度为1991 bp的基因序列，该基因命名为HAI 17。新基因定位于14号染色体上，并编码一由365个氨基酸组成的碱性蛋白，该蛋白含有4个与蛋白激酶磷酸化有关的功能位点，其功能结构域与新近发现的参与调控细胞凋亡的重要基序一“PYRIN.，，同源。【结论与意义I1 ATRA作用肿瘤细胞，不仅可使瘤细胞对户JRA本身分化作用产生耐受，而且尚可诱导瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐受即多药耐药性。这可能是临床分化治疗后肿瘤细胞难以彻底从体内清除，并导致肿瘤复发的重要原因。2多种与细胞增殖、分化和凋亡相关的己知或未知基因均可能参与了瘤细胞受ATRA诱导后继发性耐药的产生。HsP90p及可能与细胞凋亡调控有关的未知基因HAll7的发现，为进一步研究ATRA继发肿瘤细胞产生多药