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结核病（Mycobacterium，TB）是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种人兽共患慢性传染病，是由单一病原导致人类死亡的传染性疾病之一，严重危害人类身心健康。结核分支杆菌可以入侵机体的各个器官，但主要以肺结核最为常见。结核分枝杆菌的主要宿主是人类和动物，对人类而言，感染结核分枝杆菌后会引起咳嗽、发热、咳血等临床症状。MTB能在体内潜伏感染并长期存在，Rv2031c和Rv2626c是结核分枝杆菌潜伏期的两个关键的分泌蛋白。本文从潜伏期的这两个主要蛋白入手，构建真核表达载体并转染细胞，探讨结核分枝杆菌潜伏期蛋白Rv2031c和Rv2626c对细胞凋亡的影响，为进一步研究其在胞内生存机制奠定基础。1.根据GenBank中公布的结核分枝杆菌的Rv2031c和Rv2626c各设计1对特异性引物，以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组为模板，PCR扩增Rv2031c和Rv2626c目的基因。将扩增出的Rv2031c和Rv2626c基因片段克隆到pMD19-simple T载体，经PCR挑选出阳性克隆菌、双酶切和送公司测序鉴定。成功构建重组质粒并命名为pMD19-T-Rv2031c和pMD19-T-Rv2626c。分别将pMD19-T-Rv2031c和pMD19-T-Rv2626c质粒用限制性内切酶XhoI/PstI和XhoI/SalI进行双酶切，回收Rv2031c和Rv2626c基因片段，然后分别与真核表达载体pEGFP-N1进行连接，经酶切和DNA测序鉴定重组表达质粒pEGFP-N1-Rv2031c、pEGFP-N1-Rv2626c的正确性。成功构建真核表达载体并命名pEGFP-N1-Rv2031c和pEGFP-N1-Rv2626c。2.使用无内毒素大提质粒试剂盒分别提取pEGFP-N1、pEGFP-N1-Rv2031和pEGFP-N1-Rv2626c质粒。分别通过脂质体介导转染技术将3组质粒转染至293T细胞，转染24后用荧光倒置显微镜观察有绿色荧光表达。然后，提取3组细胞的总蛋白，用Western Blot方法对细胞蛋白样进行进一步验证。Western Blot显示和预期的融合蛋白Rv2031c-EGFP、Rv2626c-EGFP分子量大小相同，均为43KDa的蛋白条带。3.使用凯基公司生产的细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-APC/7-ADD染色转染3组质粒的293T细胞，通过流式细胞仪技术检测pEGFP-N1、pEGFP-N1-Rv2031c和pEGFP-N1-Rv2626c3组细胞在24h和48h的细胞凋亡率。同时，提取细胞总RNA，并进行第一链cDNA的合成，使用实时定量PCR方法检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-8mRNA水平。结果表明，转染pEGFP-N1、pEGFP-N1-Rv2031c和pEGFP-N1-Rv2626c质粒的293T细胞后24h和48h时凋亡率分别为10％、21.8％、11.3％和13％、34.8％、15.8％。Bcl-2的相对表达量在随着转染时间的增加相对表达量逐渐降低，而Bax、Caspase-3和Caspase-8随着时间的增长，相对表达量显著上升，在48h达到最高。综合分析发现结核分支杆菌Rv2031c和Rv2626c促进了细胞凋亡，为进一步研究这两个蛋白对细胞凋亡的影响以及结核杆菌在胞内生存机制奠定基础。