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研究背景:肝癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率位居我国癌症第四位,是世界范围内第二大癌症相关死亡原因,患者五年生存率不足20%。由于肝癌发病的隐匿性,多数患者确诊时已为中晚期,严重影响患者预后。肝癌治疗的首选方案是手术切除,但仅适用于15%的早期患者,而晚期患者的临床治疗方案包括全身放疗及化疗联合治疗,却存在治疗耐受等问题,导致疗效不佳。现已公认,肥胖及高脂饮食引发的代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease,MAFLD）已成为导致肝癌发病率增加的主要原因,由此代谢紊乱与肝癌之间的关系逐渐受到重视。近年研究发现,脂质代谢异常是肝癌最显著的代谢改变之一,脂质代谢途径中关键酶的激活加速了脂质生成及分解速率,为细胞提供快速增殖所需膜合成原料及细胞转移供能,进而促进肝癌的恶性演进。因此,通过干预脂质代谢途径中的关键酶及其调控因子靶向或协同治疗肝癌有望为改善患者预后提供可靠的新策略。醌氧化还原酶（NAD（P）H:quinine oxidoreductase,NQO1）是一种黄色素酶,定位于细胞质并催化真核细胞内双电子还原反应,减少醌及其衍生物的单电子还原产物半醌的形成。研究显示,NQO1在乳腺癌、肺癌、宫颈癌等多种肿瘤中高表达,并可通过调控代谢重编程参与肿瘤增殖、转移等恶性进展。本课题组前期研究表明,NQO1在肝癌组织中表达上调且与患者预后不良密切相关。Yang等研究发现NQO1通过靶向丙酮酸激酶PKLR调控糖酵解途径促进乳腺癌的恶性演进。但NQO1在肿瘤脂质代谢中的作用及机制尚未见报道。固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）是调节真核细胞脂类代谢的关键核转录因子,与肿瘤的发生发展密切相关。本研究前期发现,NQO1能够促进甘油三酯生成并上调脂质合成途径关键酶,其中SREBP1差异较为显著。但NQO1如何通过SREBP1介导脂质合成代谢,继而调控肝癌恶性演进的分子作用机制有待深入阐释。研究目的:探究NQO1/SREBP1信号轴在肝癌恶性演进中的生物学功能及其分子机制:（1）明确NQO1对肝癌增殖、转移、EMT、血管生成及脂质代谢等生物学功能的影响;（2）阐释NQO1通过SREBP1介导脂质代谢并调控Snail蛋白稳定性,继而参与肝癌恶性演进的分子机制;（3）探究NQO1与SREBP1在肝癌预后评估中的分子标志物作用。材料与方法:1.数据库及肝癌组织免疫组化结果分析:（1）通过UALCAN、TIMER等公共网络信息数据库分析NQO1在泛癌和肝癌组织中的表达情况;（2）运用免疫组化染色实验检测NQO1在肝癌组织芯片中的表达情况,并分析NQO1表达水平与患者临床病理参数之间的关系;（3）应用Kaplan-Meier plotter等数据库分析NQO1表达与肝癌患者生存期之间的关系。2.体外实验:（1）运用慢病毒转染构建NQO1沉默及过表达稳转细胞系,蛋白免疫印迹及q RT-PCR实验进行转染效果验证;（2）应用MTT、平板克隆、Ed U等实验检测NQO1差异表达后肝癌细胞增殖能力变化;（3）通过AO染色、蛋白免疫印迹实验检测NQO1对肝癌细胞自噬发生率的影响;（4）应用划痕、Transwell小室、细胞形态学观察、免疫荧光染色及蛋白免疫印迹实验观察NQO1对肝癌细胞转移能力及EMT进程的影响;（5）应用血管拟态生成、微管形成、鸡胚尿囊膜模型及HUVECs功能检测实验明确NQO1对肝癌血管生成能力的影响;（6）应用BODIPY493/503染色、甘油三酯及总胆固醇生成检测试剂盒、蛋白免疫印迹检测NQO1对肝癌细胞脂质代谢变化情况的影响;（7）运用Co IP、免疫荧光共定位染色验证NQO1与SREBP1互作关系;（8）应用蛋白合成抑制CHX、蛋白酶体抑制MG132及泛素化实验检测NQO1对p53稳定性的影响;（9）通过荧光素酶报告基因检测p53与SREBP1结合位点;（10）使用小干扰RNA、蛋白免疫印迹等挽救实验探究NQO1通过SREBP1调控肝癌增殖转移的作用机制;（11）运用数据库相关性分析、q RT-PCR、Co IP、泛素化检测等实验明确NQO1/SREBP1对Snail蛋白稳定性的影响;（12）应用小干扰RNA技术等进行回复实验,验证NQO1/SREBP1通过Snail调控肝癌的恶性演进;（13）通过GEPIA、Linked Omics等数据库检索及免疫组化染色分析NQO1与SREBP1在肝癌组织中的协同表达及其与患者生存期之间的相关性。3.体内实验:（1）构建裸鼠皮下移植瘤模型,验证NQO1对肝癌增殖能力的影响;（2）建立尾静脉注射肺转移模型,明确NOQ1对肝癌转移能力的影响;（3）运用免疫组织化学染色实验检测NQO1差异表达对肿瘤组织中Ki67、EMT和脂质代谢相关标志物蛋白表达的影响。结果:1.NQO1高表达预示肝癌患者的不良预后:数据库及免疫组化染色结果显示NQO1在肝癌组织中表达上调,临床病理参数分析发现NQO1高表达与患者肿瘤大小、病理分级相关,Kaplan-Meier plotter等数据库分析结果表明NQO1高表达患者总生存期缩短及肥胖密切相关。2.NQO1促进肝癌的恶性演进:（1）NQO1促进肝癌细胞增殖能力并抑制自噬发生:通过MTT、平板克隆和Ed U等实验发现,NQO1高表达促进肝癌细胞增殖活性、克隆形成能力及DNA复制能力;AO染色显示NQO1高表达后自噬小体减少,蛋白免疫印迹实验显示NQO1高表达下调自噬相关标志物Beclin1、p62及LC3B的表达,提示NQO1抑制自噬的发生;裸鼠皮下荷瘤模型显示NQO1高表达促进肿瘤生长;反之亦然。（2）NQO1促进肝癌细胞迁移、侵袭及EMT进程:划痕、Transwell实验发现,NQO1高表达增强肝癌细胞横向及纵向迁移能力;细胞形态学观察发现NQO1高表达细胞发生间质形态转换,免疫荧光及蛋白免疫印迹实验提示NQO1影响EMT相关标志物表达;裸鼠肺转移模型显示NQO1高表达增加肺转移结节数目;反之亦然。（3）NQO1促进肝癌细胞血管生成能力:通过血管生成拟态、微管形成及鸡胚尿囊膜模型实验发现,NQO1促进新生血管及微管形成能力;蛋白免疫印迹实验提示NQO1促进血管形成相关MMP家族及VEGF的表达;HUVECs功能实验检测显示,NQO1高表达细胞培养上清促进HUVECs增殖及迁移能力;反之亦然。（4）NQO1促进肝癌脂质合成代谢:BODIPY493/503染色、甘油三酯及胆固醇水平测定结果显示NQO1促进肝癌细胞中性脂质生成能力,蛋白免疫印迹实验发现NQO1上调脂质合成相关标志物表达。3.NQO1/p53/SREBP1/Snail在肝癌恶性演进中的作用及分子机制:（1）NQO1通过p53与SREBP1相互作用并促进肝癌恶性进展:生信分析结合Co IP、免疫荧光共定位实验发现NQO1与SREBP1相互作用;泛素化实验提示NQO1调控p53蛋白稳定性;荧光素酶报告基因检测验证p53与SREBP1序列3’UTR端启动子结合位点;MTT、划痕、Transwell等挽救实验显示NQO1/p53通过SREBP1介导脂质合成代谢促进肝癌细胞增殖、转移及EMT进程。（2）NQO1/p53/SREBP1通过泛素化调控Snail蛋白稳定性发挥促癌作用:Co IP实验验证NQO1、SREBP1与Snail互作关系;通过加入CHX、MG132及泛素化相关实验发现,NQO1/SREBP1通过泛素化发生调控Snail蛋白稳定性;MTT、划痕、Transwell等回复实验显示Snail参与NQO1/SREBP1对肝癌细胞增殖、转移能力的促进作用。4.NQO1与SREBP1可以作为肝癌预后评估和靶向治疗的分子标志物:通过生信分析结合免疫组化染色实验发现,与癌旁非瘤组织相比,NQO1/SREBP1在肝癌组织中高表达并与患者的生存期缩短密切相关,NQO1可协同SREBP1提示患者不良预后。结论:NQO1促进肝癌细胞的增殖、转移、血管生成能力及脂质合成代谢,且NQO1可通过SREBP1介导脂质代谢并调控Snail蛋白稳定性,进而促进肝癌的恶性演进;NQO1及SREBP1可作为肝癌患者靶向治疗及预后评估的有效分子标志物。