(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(R-CHBE)是用于制备手性药物的前体,包括临床上用于降低胆固醇的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(他汀类)。不对称还原反应4-氯-3-酮基丁酸乙酯(COBE)生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯主要通过生物催化来完成,生物催化具有成本低、反应条件温和、产率高以及对映体选择性等优点。生物合成(R)-CHBE的主要过程一般为:第一步,筛选适合催化还原COBE→(R)-CHBE的微生物;第二步,基因克隆、表达和酶性质鉴定;第三步,辅酶再生系统的构建;第四步,通过重组菌来生物催化COBE至(R)-CHBE。本论文从路德酵母基因组中克隆获得新型酮基还原酶基因(Ketoreductase,KR),在酵母菌中得到高效表达。KR作为NADPH依赖型的酮基还原酶,这种酶催化COBE的最适温度为30℃,最适pH为6.0。为了降低反应成本,适应大规模工业生产,本论文进一步研究了酮基还原酶KR催化COBE合成产物(R)-CHBE的不对称还原反应中辅酶的再生循环。在GS115中通过构建酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达重组菌株,利用葡萄糖脱氢酶偶联反应,即催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸反应的同时还原NADP+为NADPH进行辅酶再生。为优化NADPH再生系统,将酮基还原酶KR和葡萄糖脱氢酶GDH基因分别构建到质粒pETDUET后,转化到表达宿主菌BL21(DE3)中。以23 mM COBE和99mM葡萄糖为底物,经诱导表达的重组菌细胞为催化剂,反应5.5h后,反应产物(R)-CHBE的对映体过量值为99%,反应转化率为90%。通过辅酶再生循环方法,在不再额外添加昂贵辅酶NADPH情况下,大大提高了不对称还原反应的底物耐受性,减少了反应时间,增加了(R)-CHBE生产效率。本论文为提高酮基还原酶催化效率,以期在后续研究中实现酮基还原酶生物催化的工业应用奠定了基础。