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研究背景和假设外周血管疾病(Peripheral arterial disease,PAD)是由于血管狭窄或堵塞而引起下肢供血不足的一类疾病,常见的病因是下肢动脉粥样硬化斑块或高凝状态下血栓形成,严重下肢缺血(Critical limb ischemia,CLI)是其最晚期的疾病阶段。CLI患者的预后很差,有着极高的死亡率和截肢率,面对20%-50%不适宜接受血管重建术治疗的CLI患者,他们只能面临截肢的选择。因此,针对这样的病患,迫切需要一种血管再生的方式来改善他们的下肢血流,降低死亡率和截肢率,而干细胞移植治疗就是近二十年来被研究者和患者寄予厚望的新型治疗策略。尽管越来越的实验数据证明,干细胞移植治疗是有效且安全的,但来自于临床试验的报告却不那么尽如人意,大多数接受治疗的患者在疼痛评分、无痛行走距离、经皮氧分压等方面有了改善,但却未在死亡率和截肢率上获得任何受益。是什么导致干细胞移植的疗效远不如预期?一个重要且容易被忽视的因素是患者缺血下肢复杂的微环境。尤其当这些CLI患者伴随着长期的代谢失衡疾病,例如动脉粥样硬化和糖尿病,那么他们的机体环境就会对移植干细胞造成损伤。酸中毒,是在缺氧和炎症环境下的典型病理特征,它由于代谢方式的转变而产生并常常伴随着细胞外环境中pH值的下降。早前的临床报告指出,与健康人群相比,PAD患者的腓肠肌表面pH普遍下降,并且随着病变程度的加深pH不断下降,在下肢坏疽的CLI患者中,腓肠肌表面pH被降至6.85.因此,可以认为pH的水平在某种程度上反应了下肢缺血的严重程度,这同时意味着不同CLI患者的下肢具备不同pH微环境,移植干细胞需要面临不同的pH条件,而这些不同的pH条件又可以不同程度地影响干细胞性能,因此在找到改善途径规避损伤前我们需要全面了解细胞外酸中毒可能产生的损伤。针对于细胞外酸中毒对于移植细胞生物学效应的影响,我们聚焦于一个质子感受器家族成员GPR65,它在pH<7.4的酸性条件下被活化,并且在pH=6.2-6.8之间达到最大活性,因此非常符合CLI的病理微环境。有研究指出,GPR65能通过Bcl-2途径有效抵御酸中毒诱导的凋亡,同时能显著抑制免疫和炎症反应。因此,本研究的目的在于探索GPR65的修饰是否能够减轻酸中毒对脂肪来源间充质干细胞的损伤(Adipose-derived stem cells,ADSCs)是否能改善其在酸性微环境的生存率及相应生物学效应,并通过体内外实验加以验证,为高干细胞临床治疗功效供一个潜在的靶向基因。研究方法我们首先建立严重下肢缺血裸鼠模型,利用微透析技术探测缺血事件发生后0.5-72小时缺血下肢肌肉的代谢水平,已确定缺血下肢中确实存在细胞外酸中毒。然后,基于人的脂肪组织成功分离出原代脂肪来源间充质干细胞(ADSCs),并确定其具备良好分化潜能以及能够稳定传代。接下来,在体外实验中,我们利用pH=7.4/7.2/7.0/6.5的酸性培养基处理ADSCs 24/48小时,从细胞功能、细胞亚细胞器形态和转录水平分析细胞外酸中毒对ADSC造成的损伤。在针对GPR65的研究中,我们首先构建了GPR65过表达质粒,在病毒包装及感染ADSC后,成功建立起GPR65-OE ADSC。随后,同样在上述酸性条件下处理ADSCs 24/48小时,比对GPR65-OE/Vector修饰ADSC在细胞功能和细胞亚细胞器形态上的差异,并同样利用RNA-Seq测序技术对两个实验组进行分析,试图探讨GPR65发挥功能潜在的调控机制。最后,我们将GPR65修饰的ADSC移植进入严重缺血裸鼠下肢,检测缺血下肢血流灌注、侧枝循环生成以及血管新生情况,同时在PBS、ADSC、Vector和OE-GPR65四组间进行对比,以确定GPR65在体内是否能有效高ADSC在严重下肢缺血中的治疗功效。研究结果严重缺血下肢的微透析结果显示,在缺血事件后0.5-72小时,下肢肌肉中乳酸含量剧烈上升,间接反映了缺血区域的酸性微环境。此外,在相同条件下相同时间段内的监测发现,下肢肌肉中葡萄糖含量持续下降,示局部组织能量代谢异常。体外实验结果显示,细胞外酸中毒抑制ADSCs增殖与活力,诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、加速细胞衰老进程以及诱导线粒体损伤,而GPR65的基因修饰可促进酸性环境下ADSC的增殖与活力,抵御酸诱导的凋亡,推动细胞周期,改善线粒体功能。此外,RNA-Seq分析结果与以上表型相符,示上调GPR65可推动周期、稳定染色质以及促进分裂,并抑制免疫、炎症反应。最后,体内实验证实,GPR65过表达的ADSC相较于PBS组、ADSC对照组及空载对照组,能够显著改善缺血下肢的血流灌注情况、侧枝循环生成程度及血管新生水平。研究结论细胞外酸中毒微环境能诱导移植ADSC凋亡,显著抑制其多种生物学效应,而质子感受器GPR65可有效抵御酸中毒介导的损伤,在体外酸性环境下高ADSC生物有效性,在严重缺血的裸鼠下肢中GPR65显著高ADSC治疗功效,有望成为改善干细胞移植治疗效率的靶基因。