论文部分内容阅读
研究背景:负压创面治疗(Negative pressure wound therapy,NPWT)促进创面愈合的具体机制并未阐述清楚。近年来,研究人员发现,细胞不仅受到生物化学信号时空变化的调控,还对细胞外基质的结构、硬度和三维应变场等物理因素的时空变化产生响应,通过激活不同的信号传导途径,调整细胞行为学变化。在组织再生和创伤修复领域,力学信号调控的重要性也逐渐受到临床医生和研究人员的重视。NPWT皮肤力学微环境时空变化还未阐述清楚。以往研究表明,细胞力学微环境通过调控YAP/TAZ向细胞核内定位转移,是细胞迁移、增殖的重要环节。NPWT是否通过改变力学微环境,调控YAP/TAZ信号促进创面主要修复细胞迁移、增殖,从而促进创面愈合,有待进一步深入研究。研究目的:针对以上问题,本课题旨在通过观察NPWT对创面力学微环境的改变,研究组织硬度、应变场通过YAP/TAZ信号促进创面愈合的具体机制,并通过体外构建仿真NPWT作用下细胞三维力学微环境进一步研究NPWT促进创面愈合的分子机制,从而开发一种完整系统的创面力学生物学研究方法,为开展相关研究提供新的研究思路,也为NPWT敷料的优化及个体化治疗提供力学生物学理论支撑。方法:第一部分NPWT作用下兔背全层缺损创面皮肤力学微环境的时空变化1.(1)24只新西兰大白兔,于兔背侧脊椎中线两侧旁开1cm处各切割出2cm直径圆形创面,深达肌肉层,随机分为不同负压值(-50、-80、-125、-150 mmHg)NPWT组和对照组(普通纱布覆盖)(N=6只/组),每日观察比较创面愈合情况;(2)随机选取2只兔子,分别于术后1天和5天行MR三维重建后建立有限元数值模型,并同时行剪切波弹性成像(Shear wave elastography,SWE)检测各组兔背创面皮肤软组织硬度;(3)将上述实验参数进行拟合处理后,输入ABQUES软件设置边界条件,施加上述不同负压载荷,采用非线性超弹性有限元分析方法(Finite Element Analysis,FEA)获取术后第1天和第5天距创缘和创基0、5、10mm组织区域的三维应力应变分布数据;(4)组装基于数字图像相关方法(Digital Image Correlation,DIC)的三维数字散斑应变测量分析系统;(5)喷涂散斑;(6)采集数据及统计学分析。采用SPSS 19.0对数据进行统计学分析。分别在术后第1天和第5天,采集NPWT(-50、-80、-125、-150 mmHg)加载下,兔背全层皮肤缺损创面整个动态过程的等效应变数据,利用SPSS软件,将数据同有限元分析获取的应变数据进行比较分析,数值以均数和标准差表示,两两比较采用单因素方差分析,检验水准n=0.05,P<0.05表示差异具有统计学意义,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。第二部分NPWT通过调控YAP/TAZ信号在促进兔背全层皮肤缺损创面愈合的作用2.(1)将海绵敷料剪成1×2 cm小长条,缝线缝合固定于创面。在术后第1天和第5天切取海绵敷料相连的创缘及创基组织,经福尔马林固定、石蜡包埋后行HE染色,显微镜下进行组织学观察;(2)于术后第1和第5天分别切取连接海绵敷料的创缘及创基组织,经福尔马林固定、石蜡包埋后行Masson染色,显微镜下进行组织学观察;(3)免疫荧光染色检测各组YAP、TAZ、NMosyin IIB和PCNA在创面中的定位表达;(4)Western blotting检测各组YAP、TAZ核内定位表达;(5)定量PCR检测各组YAP、TAZ mRNA表达。第三部分体外构建模拟不同负压NPWT作用下细胞三维力学微环境3.(1)聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene,PTFE)超弹性材料参数拟合;(2)PTFE弹性培养板有限元几何物理模型制备;(3)应变和位移分析、组装定制化球形梯度应变细胞自动化拉伸装置;(4)明胶-β-CD复合三维水凝胶的制备;(5)剪切波弹性成像检测水凝胶组织硬度。结果:1.(1)与对照组相比,-50、-80、-125 mmHg NPWT组的创面愈合时间均缩短(P<0.05),-150 mmHg组无明显差异(P>0.05);(2)-50、-80、-125、-150 mmHg组和对照组创面皮肤的杨氏模量(组织硬度)在术后第1天分别为9.5±1.4、9.8±2.1、10.5±2.3、11.5±2.3和21.8±3.3 kPa,第5天分别为21±3.1、22±2.3、22.5±2.4、23.1±2.2和31.7±2.6 kPa。NPWT不同负压值设定组的杨氏模量值之间无统计学差异(P>0.05),各自组创面的硬度在第5天均比第1天大(****P<0.0001),对照组在第1天、第5天均比NPWT组平均值大,差异有统计学意义(****P<0.0001);(3)创缘应变值随创面愈合时间延长而减小;(4)NPWT下创缘形成梯度应变场,应变值和梯度均随愈合时间而减小;(5)三维数字散斑应变分析测量结果显示:-50至-150 mmHg NPWT在创面水平方向形成向外递减的应变梯度,对比-50、-80、-125、150 mmHg NPWT组第1天和5天创缘应变值与FEA获取的应变值,未有显著性差异(P>0.05)。2.(1)NPWT(-50、-80、-125 mmHg)促进兔背创面肉芽组织形成和创基胶原合成;(2)免疫荧光显示:各NPWT组术后第5天NMIIB在创面与海绵敷料接触部位定位表达,PCNA在-50、-80和-125 mmHg NPWT组术后第5天表达升高;(2)WB显示:-50、-80和-125 mmHg组YAP/TAZ核内表达在第5天较对照组和-150 mmHg组升高,差异有统计学意义(P<0.01);(3)PCR显示:YAP/TAZ mRNA表达在-50、-80和-125 mmHg组术后第1天较-150 mmHg组升高,第5天较对照组和-150 mmHg组均升高,差异有统计学意义(P<0.0001)。3.(1)建立基于弹性培养板的非均匀应变梯度细胞拉伸装置;应变梯度可精度调整;(2)建立基于仿真创面组织硬度的水凝胶三维培养环境。结论:1.首次整合MR 3D成像、SWE、非线性FEA和DIC序列方法,阐述NPWT作用下创面软组织硬度、应变场及梯度的时空变化。创面愈合过程中,创面皮肤软组织硬度增加,这可能有利于细胞迁移,以促进创面愈合。NPWT作用下创缘应变及梯度值随创面愈合而减小,这点应当受重视但经常在NPWT过程中被忽视。2.初步证明适当负压值NPWT作用下通过优化创面软组织硬度和应力应变场,激活YAP/TAZ核内转移,促进皮肤主要修复细胞的增殖、迁移,从而促进肉芽组织形成和血管化等过程。3.首次建立精度可调的仿真不同负压NPWT作用下细胞三维力学微环境。