论文部分内容阅读
目的：探讨连续鞘内注射雷帕霉素(Rapamycin)对小鼠神经病理性痛行为的影响以及脊髓水平mTOR信号通路在CCI诱发的神经病理性疼痛中的作用机制。 方法：痛行为学实验：选择鞘内置管成功、无运动障碍及严重体重减轻的成年雄性C57/BL6小鼠48只，随机分为两组：假手术组(sham组，n=24)和慢性坐骨神经损伤模型组(CCI组，n=24)。建立模型后将各组随机分为三组，组一不做任何处理，组二在术后1－6d鞘内注射雷帕霉素1μg/5μl，组三鞘内给予溶媒20％DMSO5μl(sham，sham+R，sham+V，CCI，CCI+R，CCI+V，n=8)。在术前1d，术后1d，3d，5d，7d，10d，14d，17d，21d，28d检测小鼠双侧足底机械缩足阈值(Paw MechanicalWithdraw Threshold，PWMT)和热辐射缩足潜伏期(Paw Thermal WithdrawLatency，PTWL)。分子生物学实验：在未接受药物干预的sham组第7d以及CCI术后1d，3d，5d，7d，10d，14d，17d，21d，深麻醉状态下以颈椎脱臼的方式处死小鼠，取L4～5节段脊髓保存于－80℃冰箱，待用Western blot检测脊髓水平磷酸化mTOR(Ser2448)和总的mTOR的时间依赖的表达量。雷帕霉素干预后，各组于第7d，14d处死小鼠，取L4～5节段脊髓保存于－80℃冰箱，待用Western blot检测脊髓水平mTOR信号蛋白[t-mTOR/p-mTOR，t－4EBP1/p一4EBP1(thr-37/46)，t-p70S6K/p-p70S6k(thr-389)]和PSD95的表达变化，以及待用Co-immunoprecipatation检测PSD95与NR2B，PSD95与GluA2的相互作用。 结果：(1)痛行为学变化：与sham组相比，CCI组小鼠手术侧足底PTWL和PMWT均明显降低[第7d，PTWL：(7.03±0.71)，(3.26±0.66)s，F=38.27，P<0.05；PMWT：(1.02±0.12)，(0.42±0.12)g，F=51.01，P<0.05；]。而CCI后1－6d鞘内注射雷帕霉素1μg/5μl，使小鼠的PMWT明显升高[第7d，(0.42±0.18)，(0.86±0.25)g，F=6.56，P<0.05]，并且至少持续至术后10d。然而，雷帕霉素对CCI小鼠的热痛觉过敏仅有缓解趋势，没有统计学差异。sham组和对侧足底痛行为未见明显改变(P>0.05)。(2)分子生物学结果：与sham组相比，脊髓水平p-mTOR的表达于CCI后1d开始表达增加，第10d达峰值，之后表达下调但21d时仍处于较高水平。而t-mTOR未见明显改变。与溶媒组相比，鞘内注射雷帕霉素组脊髓水平p-mTOR，p-4EBP1，p-p70S6K以及PSD95的表达下调，而t-mTOR，t－4EBP1，t-p70S6K表达无明显差异。Co-immunoprecipatation结果显示，CCI后PSD95与NR2B以及GluA2的相互作用在第7d增加，而PSD95与GluA2相互作用的增强持续至第10d。雷帕霉素同样可以抑制这种相互作用的增强。 结论：CCI诱发的神经病理性疼痛小鼠脊髓水平mTOR信号途径相关蛋白活化形式表达明显增加，鞘内注射mTOR特异性抑制剂雷帕霉素可以抑制各种蛋白的活化并且可有效缓解CCI小鼠的机械痛觉异常。脊髓水平mTOR信号在CCI诱发的持续性疼痛中发挥重要作用。CCI后1－6d鞘内注射雷帕霉素降低了脊髓水平PSD95表达量以及PSD95介导的蛋白相互作用的增强。因此我们推断脊髓mTOR信号通过调控PSD95的表达以及其与谷氨酸受体亚基的相互作用参与CCI诱发的神经病理性疼痛的发生与维持。