目的：支气管哮喘(简称哮喘)是一种以炎症细胞如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等浸润为主的慢性气道炎症性疾病,世界哮喘人口约有2亿,最高发病率达到18%,而我国哮喘人口的发病率在0.5-1.5%,哮喘病人达到3000万。目前普遍认为在哮喘的遗传易感人群中,正常环境中的变应原可引起机体的不适当免疫应答,从而导致哮喘气道炎症的发生与发展。其中,屋内尘螨、内毒素、病毒感染等因素在哮喘气道炎症中的作用受到了越来越多学者的关注,这些环境中的变应原可以与机体的主要模式识别受体结合,通过激活不同的细胞内信号转导通路,诱导出不同的基因表达模式,从而引起各种促炎因子的释放,一方面诱导体内各种抗原提呈细胞(APC)如树突状细胞(DC)的活化,激活体内的内源性免疫反应,同时另一方面调节T淋巴细胞的分化,促进特异性抗原诱导的获得性免疫反应的发生与发展,诱导机体的炎症反应。Toll样受体(TLRs)是机体的一种重要的跨膜蛋白,在识别机体自身和异体抗原以及有害和无害的抗原中起重要的作用,其中Toll样受体4(TLR4)是屋尘螨(HDM)的主要模式识别受体。HDM通过激活TLR4/NF-κB信号转导途径,使气道内DC活化,进而诱导T淋巴细胞分化,同时可促进化学趋化因子及白细胞介素(IL)-25、IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等各种促炎因子的释放,募集气道内炎症细胞,调节不同炎症细胞的存活周期,从而在哮喘的气道炎症反应中发挥重要作用。以槲皮素为代表的黄酮类化合物,是一种常见的植物雌激素,广泛存在于日常的多种蔬菜和水果中,如洋葱、草莓、苹果、蓝莓等。据统计,人们从日常的饮食中获取的槲皮素日均摄入量大约为25 mg。目前大量的研究证明,槲皮素具有多种生物抗炎活性,在机体抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血小板聚集、降糖、调节血脂、扩张血管等方面均有显著的作用,已经被认为是最有前途的用于预防和治疗炎症相关性的慢性疾病的饮食药物之一；然而,槲皮素对机体TLRs介导的NF-κB信号通路引起的炎症反应的是否有影响尚不明确,槲皮素的抗炎活性在减轻变态反应性疾病如支气管哮喘的气道炎症方面的机制有待于进一步的阐明。因此,我们的课题研究着眼于槲皮素通过调节TLR4/NF-κB信号通路的活化,进而影响各种炎性因子的产生与释放,从而进一步明确对哮喘的气道炎症反应的调节机制。本研究拟运用HDM诱导哮喘小鼠动物模型,通过气道上皮TLR4/NF-κB信号转导途径诱导DC活化,进而检测IL-25等各种促炎性因子的释放,通过测定IL-4, IL-5, IL-13等Th2淋巴细胞及IFN-y等Thl淋巴细胞相关炎症介质的表达,从而进一步明确固有性免疫和获得性免疫反应在哮喘炎症中的重要作用,更加深入明确哮喘的病因和发病机制。同时,应用槲皮素干预后,观察哮喘小鼠动物模型中TLR4/NF-κB mRNA和蛋白的表达水平以及气道内各种炎症细胞与炎症因子的表达水平的变化。此外,本研究观察了哮喘患者PBMCs中TLR4/NF-κB mRNA的表达及对炎症因子释放的影响,并观察体外槲皮素干预后上述指标的变化,进一步明确槲皮素通过调节TLR4/NF-κB信号通路在哮喘气道炎症中的作用机制。因此,本课题进一步明确了TLR4/NF-κB信号通路介导的机体炎症反应机制,探讨了槲皮素在调节TLR4/NF-κB信号通路,影响机体T淋巴细胞分化,恢复Thl/Th2淋巴细胞平衡,改善炎症因子的释放,以及阻断哮喘气道炎症的发生及发展进程中的作用,可能为支气管哮喘的发病机制研究以及治疗方法提供新的更为有效的措施。方法：第一部分：雌性BALB/c小鼠40只随机分为A组(PBS对照组),B组(HDM哮喘模型组)和C组(HDM+槲皮素干预组),8-10周龄,体重(25±5)g,置于同一饲养室内,通风良好,自由饮水和摄食。A组在整个建模过程中给予PBS代替HDM进行对照,B组用HDM提取液鼻内滴入诱导建立小鼠哮喘模型,C组在建模的过程中给予槲皮素鼻内滴入干预。用小鼠肺功能仪有创肺阻抗方法检测小鼠的气道反应性变化,苏木素伊红(HE)染色方法观察小鼠气道及肺组织炎症浸润情况；细胞计数板对小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中各细胞分类及计数；酶联免疫吸附方法(ELISA)检测各组小鼠BALF上清中IL-25、IL-4,IL-5, IL-13, IFN-y和GM-CSF的表达；实时定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)方法测定小鼠气道上皮TLR4mRNA和NF-κB (p65) mRNA的表达水平,免疫印迹方法(Western blotting)方法检测小鼠肺组织中TLR4和NF-κB (p65)蛋白的表达强度。流式细胞术(FCM)方法检测DC表面CD80、CD86共刺激分子的表达。第二部分：抽取20例急性发作期哮喘患者的外周静脉血10 ml,各加入EDTA1.2 mL抗凝,按照密度梯度离心法分离出PBMCs,并分为两份,一份加入槲皮素和PHA培养24h(槲皮素组),另一份仅加入PHA培养24h (PHA对照组),培养后分别收集上清液及细胞沉渣,采用ELISA法测定上清液中IL-6和TNF-a的表达水平,RT-PCR方法测定细胞沉渣中TLR4和NF-κB (p65) mRNA的表达强度。统计学分析：所有实验数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS17.0软件进行数据处理分析。多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。P<0.05表示有统计学意义,P<0.01表示有显著统计学意义。免疫组化图片采用Image-prol-plus软件分析。结果：1.HDM诱导的哮喘小鼠模型临床表现以小鼠出现明显的烦躁不安,活动频繁,呼吸急促,腹肌抽搐,大、小便失禁,毛发竖起,部分小鼠出现反应迟钝,动作迟缓等为HDM诱导哮喘动物模型成功的标志。2.HE染色观察小鼠肺组织病理学改变高倍光学显微镜下观察可见,A组未见炎性表现,B组小鼠炎症表现明显,气道及肺组织周围可见以嗜酸性粒细胞为主的大量炎症细胞浸润,气道上皮细胞脱落坏死,黏膜皱褶增多,黏液腺增生,管壁增厚,管腔狭窄等,C组小鼠的炎性表现明显减轻,气道及肺组织周围炎症细胞减少,肺泡壁基本结构完整。3.有创肺阻抗方法检测小鼠的气道反应性变化各组小鼠的呼气阻力基础值之间无显著差异,注射乙酰甲胆碱(mAch)激发后,与A组小鼠相比,B组小鼠呼气阻力显著增高(P<0.05),表明哮喘小鼠的气道反应性明显高于对照组小鼠,哮喘模型制备成功。与B组相比,C组小鼠的气道反应性均显著下降(P<0.05)。4.血细胞计数板对小鼠BALF沉淀中炎症细胞分类计数与A组相比,B组小鼠BALF沉淀中细胞总数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞水平均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),与B组相比较,C组小鼠小鼠的细胞总数及嗜酸性粒细胞数量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。5.ELISA方法检测各组小鼠BALF上清中IL-25、IL-4,IL-5, IL-13, IFN-y和GM-CSF的表达水平与A组相比,B组BALF上清中IL-25、IL-4, IL-5, IL-13和GM-CSF的表达水平均明显增高,而IFN-y表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05),与B组相比较,C组小鼠BALF上清中IL-25、TSLP、IL-4, IL-5, IL-13和GM-CSF的水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),而IFN-y水平均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。6. qRT-PCR方法测定各组小鼠肺组织TLR4 mRNA的表达水平与A组相比,B组小鼠肺组织中TLR4 mRNA的表达水平显著增高,差异有统计学意义(P=7.251×10-6),与B组相比较,C组小鼠小鼠肺组织中TLR4mRNA的表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P=8.140×10-7)。7. qRT-PCR方法测定各组小鼠肺组织NF-κB (p65) mRNA的表达水平与A组相比,B组小鼠肺组织中NF-κB(p65)mRNA的表达水平显著增高,差异有统计学意义(P=8.748×10-7),与B组相比较,C组小鼠肺组织中NF-κB (p65) mRNA的表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P=2.194×10-6)。8.Western blotting检测各组小鼠肺组织TLR4蛋白的表达强度与A组相比,B组小鼠肺组织中TLR4蛋白的表达强度显著增高,差异有统计学意义(P=6.251×10-7),与B组相比较,C组小鼠肺组织中TLR4蛋白的表达强度显著降低,差异有统计学意义(P=4.947×10-7)。9. Western blotting方法检测各组小鼠肺组织NF-κB (p65)蛋白的表达强度与A组相比,B组小鼠肺组织中NF-κB (p65)蛋白的表达强度显著增高,差异有统计学意义(P=8.013×10-7),与B组相比较,C组和小鼠肺组织中NF-κB(p65)蛋白的表达强度显著降低,差异有统计学意义(P=3.846×10-7)。10.流式细胞术检测DC的CD80的表达水平与A组相比,B组小鼠DC的CD80表达水平显著增高,差异有统计学意义(P=7.935x10-7),与B组相比较,C组小鼠DC的CD80的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P=5.902x 10-7)。11.流式细胞术检测DC的CD86的表达水平与A组相比,B组小鼠DC的CD86表达水平显著增高,差异有统计学意义(P=2.964×10-6),与B组相比较,C组小鼠DC的CD86的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P=7.531×10-8)。12. RT-PCR方法测定哮喘患者PBMCs培养后细胞沉淀中TLR4 mRNA的表达强槲皮素组PBMCs培养后的细胞沉淀中TLR4 mRNA的表达强度较PHA对照组均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。13. RT-PCR方法测定哮喘患者PBMCs培养后细胞沉淀中NF-κB (p65) mRNA的水平槲皮素组PBMCs培养后的细胞沉淀中NF-κB (p65) mRNA的表达强度较PHA对照组均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。14. ELISA方法测定哮喘患者PBMCs培养后上清液中IL-6的表达水平槲皮素组PBMCs培养后上清液中IL-6的表达水平分别较PHA对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。15. ELISA方法测定哮喘患者PBMCs培养后上清液中TNF-a的表达水平槲皮素组PBMCs培养后上清液中TNF-a的表达水平分别较PHA对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1.TLR4/NF-KB信号通路的激活,在哮喘的气道炎症反应中发挥重要作用。2.TLR4介导的信号途径可诱导DC活化,是哮喘固有性免疫反应与获得性免疫反应相互作用中的关键环节。3.槲皮素可以通过下调气道上皮TLR4/NF-κB的表达,减轻哮喘的气道炎症。