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第一部分Gephyrin棕榈酰化在大鼠焦虑样行为中的作用目的:桥蛋白(Gephyrin)是调节γ-氨基丁酸A型受体(γ-aminobutyric acid type A receptor,GABA_AR)突触定位的关键性锚定蛋白,也是抑制性突触的重要骨架蛋白。由于和gephyrin相互作用的蛋白大多和多种神经精神疾病密切相关,gephyrin功能异常可能在癫痫、自闭症和精神分裂症等疾病的发生中也扮演了重要角色。棕榈酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,调控蛋白质的转运、定位及功能。近年来的研究发现gephyrin棕榈酰化修饰调节其和GABA_AR的相互作用。鉴于受gephyrin调节的GABA_AR功能与焦虑行为关系密切,我们推测gephyrin功能变化可能也参与了焦虑行为的产生。本实验采用多种焦虑模型和实验方法,进一步研究gephyrin棕榈酰化在大鼠焦虑样行为中的可能作用。方法:利用高架十字迷宫(elevated plus maze,EPM)筛选高焦虑大鼠(high-anxiety,HA)和低焦虑(low-anxiety,LA)大鼠;采用慢性皮质酮暴露法建立应激相关焦虑模型;利用酰基-生物素交换(acyl-biotinyl exchange,ABE)法检测基底杏仁核(basolateral amygdala,BLA)全蛋白、GABA_AR各亚基及gephyrin的棕榈酰化;通过EPM及旷场实验(open field test,OFT),检测N-叔丁基羟胺(N-(tert-Butyl)hydroxylamine,NtBuHA)对焦虑行为的影响,并通过电生理检测微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic potential currents,mIPSCs)和ABE法检测棕榈酰化研究其机制;检测干扰GABA_AR与gephyrin间作用的GABA_ARα3 peptide对mIPSCs和焦虑行为的影响。结果:(1)通过EPM筛选得到天然焦虑大鼠,根据在开放臂的运动时间将前40%的大鼠定义为LA鼠,后10%定义为HA鼠,中间比例为中等焦虑(intermediate-anxiety,IA)鼠。(2)通过ABE法发现较LA鼠,HA鼠BLA脑区全蛋白棕榈酰化水平显著降低;而GABA_AR各亚基的表达及棕榈酰化修饰均未发生显著变化,但HA鼠gephyrin棕榈酰化修饰显著减少(LA:100.0±4.6%,HA:68.9±4.6%,n=5,P<0.01)。(3)慢性皮质酮暴露显著增加大鼠焦虑样行为,ABE法检测结果表明慢性皮质酮减少大鼠BLA全蛋白棕榈酰化水平,同时降低gephyrin棕榈酰化修饰(Veh组:100.0±4.0%,Cort组:63.2±9.1%,n=6,P<0.01)。(4)NtBuHA(1.0 mM)明显减少棕榈酰化修饰;BLA脑区给予NtBuHA后30 min,大鼠焦虑水平明显增加;全细胞膜片钳记录结果表明NtBuHA下调mIPSCs的幅度(Veh组:12.9±0.5 pA,NtBuHA组:10.4±0.6 pA,n=16 cells from 8 rats,P<0.01)。Western blotting结果也证明NtBuHA减少gephyrin棕榈酰化修饰(Veh组:100.0±8.9%,NtBuHA组:66.2±5.9%,n=7,P<0.01)。(5)干扰GABA_AR与gephyrin之间作用的GABA_ARα3 peptide明显下调mIPSCs的幅度(Veh组:13.05±0.8 pA,NtBuHA组:10.2±0.4 pA,n=12-13 cells from 10 rats,P<0.01),通过抑制GABA_AR各亚基与gephyrin间的相互作用而产生焦虑样行为。结论:在天然焦虑模型及皮质酮暴露模型中,随着焦虑水平升高,蛋白质棕榈酰化修饰明显减少。使用NtBuHA减少BLA区gephyrin棕榈酰化修饰增加大鼠焦虑行为。同时,使用GABA_ARα3 peptide可明显干扰gephyrin与GABA_AR各亚基之间的作用,提示gephyrin的棕榈酰化修饰是调节焦虑样行为的重要靶点。第二部分Gephyrin棕榈酰化在地西泮抗焦虑效应中的作用及机制目的:苯二氮?类药(benzodiazepines,BDZs)与GABAAR结合后,引发受体蛋白构象改变,促进GABA与GABAAR结合,使Cl-通道开放频率增加,从而加强GABA对神经系统的抑制效应。有研究表明gephyrin棕榈酰化修饰随抑制性神经元活性的升高而增加。结合gephyrin棕榈酰化在调节焦虑行为中的作用,本实验进一步探讨gephyrin棕榈酰化在地西泮(diazepam,DZP)抗焦虑行为中的作用及机制。方法:定量-聚合酶链式反应(quantitative ploymerse chain reaction,q-PCR)检测焦虑模型大鼠BLA脑区棕榈酰基转移酶的m RNA水平,通过Western blotting检测天然焦虑模型及皮质酮焦虑模型中gephyrin特异性的棕榈酰基转移酶DHHC12的表达水平;Western blotting检测DHHC12和gephyrin在大鼠各重要脑区的分布情况;腹腔注射DZP 30 min后检测其对gephyrin棕榈酰化修饰及DHHC12活性的影响;利用慢病毒(lentic virus,LV)沉默BLA脑区的DHHC12,通过EPM及OFT观察沉默BLA区DHHC12对焦虑样行为和DZP抗焦虑效应的影响;利用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)过表达BLA脑区DHHC12,结合腹腔注射氟马西尼(flumazenil,FMZ)观察过表达BLA脑区DHHC12对焦虑样行为的影响。结果:(1)q-PCR检测发现,在天然焦虑大鼠模型中,DHHC12 m RNA水平在HA鼠的BLA区中明显低(LA组:100.0±4.4%,HA组:82.5±3.4%,n=8,P<0.01)。(2)Western blotting检测发现gephyrin在m PFC表达最高,BLA脑区次之;DHHC12在BLA区表达最高。(3)腹腔注射DZP不仅显著升高BLA脑区的全蛋白棕榈酰化水平,而且上调gephyrin(Veh组:100.0±5.0%,DZP组:154.4±6.8%,n=6,P<0.001)及DHHC12的棕榈酰化修饰水平(Veh组:100.0±13.4%,DZP组:157.7±14.9%,n=8,P<0.01)。(4)LV-DHHC12明显下降BLA脑区的DHHC12(LV-e GFP-sh RNA组:100.0±6.6%,LV-DHHC12-sh RNA组:55.0±10.1%,n=4,P<0.05),腹腔给予DZP进行EPM及OFT检测,发现沉默BLA区DHHC12表达增加大鼠焦虑样行为,同时也取消DZP的抗焦虑作用。(5)通过AAV-DHHC12过表达DHHC12(AAV-e GFP组:100.0±9.1%,AAV-DHHC12组:310.1±46.3%,n=8,P<0.001),腹腔给予FMZ检测EPM及OFT,表明在BLA区过表达DHHC12产生明显的抗焦虑作用,这种抗焦虑效应会被FMZ取消。结论:Gephyrin棕榈酰化在DZP抗焦虑效应中发挥重要作用,其主要机制可能是DZP通过增加GABAAR活性,激活DHHC12自身棕榈酰基转移酶活性的“乒乓机制”,进而增加底物gephyrin的棕榈酰化,最终增加GABAAR膜表达和突触后募集,参与其抗焦虑作用。