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猪附红细胞体病是一种人畜共患病,猪感染后症状主要表现为黄疸、发热和贫血。猪附红细胞体主要以黏附于红细胞的方式入侵宿主细胞,而这种黏附由黏附蛋白来调节,即在宿主细胞和黏附蛋白之间的一个很小的空间内发生作用,但对这种粘附作用的功能性基因研究甚少。本试验构建猪外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库,再构建猪附红细胞体α-烯醇化酶基因酵母双杂交诱饵表达载体,在构建的猪外周血单个核细胞PBMC酵母表达文库中筛选与猪附红细胞体α-烯醇化酶相互作用的宿主蛋白,并进行鉴定。为猪附红细胞体细胞粘附和侵袭机制在蛋白水平上提供基础研究。猪外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库构建：为构建猪外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库,本试验无菌采取建康猪抗凝血,分离外周血单个核细胞,并提取细胞总RNA。应用SMART技术反转录合成双链cDNA (ds cDNA)。利用CHROMA SPINT+ TE-400Columns纯化柱纯化ds cDNA,并与线性化的pGADT7-Rec载体共转化酵母菌菌株Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建PBMC酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,总RNA浓度为1143ng/μ, OD260/OD280为1.90,构建的文库容量为3.11x108 CFU/mL,随机挑取了23个单个菌落进行PCR扩增鉴定后发现插入的双链cDNA片段平均长度约2000bp,主要集中在400 bp-4000 bp之间,且文库重组率为100%。此次构建的cDNA文库可用于酵母双杂交筛选。α-烯醇化酶诱饵载体pGBKT7-enolase的构建：本试验为了替换a-烯醇化酶基因序列中的终止密码子,根据发表的猪附红细胞体全基因组序列(NC-015153.1),设计并合成了三对引物,利用Overlap PCR定点突变,扩增得到了全长基因序列,再将其与pMD18-T Simple Vector克隆载体连接,通过双酶切将α-烯醇化酶基因全长序列定向克隆到酵母表达载体pGBKT7上,构建了诱饵载体pGBKT7-enolase,并对其进行了测序、自激活和毒性作用鉴定。结果显示Overlap PCR扩增得到α-enolase全长为1623 bp,测序结果与NCBI上α-enolase基因序列比对存在23处碱基突变和1处氨基酸突变,核苷酸同源性98.6%,氨基酸同源性99.8%。将pGBKT7-enolase转化酵母感受态Y2H,菌落PCR表明pGBKT7-enolase成功转入,毒性作用试验证明pGBKT7-enolase对酵母细胞生长无毒性,自激活试验证明pGBKT7-enolase对酵母双杂交报告基因无自激活现象。说明构建的诱饵载体pGBKT7-enolase可用于酵母双杂交筛选。酵母双杂交筛选与α-烯醇化酶互作的宿主蛋白：为筛选互作蛋白,本试验将诱饵载体pGBKT7-enolase转化酵母菌Y2H,将其与转化了外周血单个核细胞dscDNA的Y187酵母菌在50mL2×YPDA营养液体培养基(Kan)进行杂交筛选。结果显示,在SD/-4缺陷固体培养基(Kan)上长出了162个白色、边缘整齐、隆起的单菌落。单菌落转移到SD/-4/X/A板上后有33个菌落变成了蓝色。利用文库通用引物PCR扩增蓝色菌落,1.0%凝胶电泳显示条带主要集中在250-2000 bp之间,测序后比对结果发现有四种蛋白与试验相符,分别是24号蛋白endonuclease/reverse transcriptase、25号蛋白beta actin, partial、26号蛋白60Sribosomal protein L11, partial和28号蛋白clusterin precursor,且克隆数分别为3、4、3和1。共转化试验鉴定互作蛋白：将酵母质粒转化大肠杆菌感受态纯化后,分对照组和试验组,并分别将各组质粒转化于Y2H酵母感受态中,150mm SD/-2、SD/-4, SD/-4/X/A平板(Kan)30℃恒温培养箱倒置培养3-4d。结果显示,pGADT7-24、 pGADT7-25、pGADT7-28+pGBKT7-enolase三个组分别在SD/-4和SD/-4/X/A平板上长出了白色和蓝色菌落,这与文库筛选结果相符。而pGADT7-24+pGBKT7组在SD/-4和SD/-4/X/A平板上长出了白色和蓝色菌落,这与预期结果不符,为假阳性蛋白,表明24号蛋白Endonuclease/reverse transcriptase存在自激活,即在没有a-enolase基因存在的条件下能自己激活酵母双杂交报告基因,固在后续试验中我们对其将不再研究。而26号蛋白60S ribosomal protein L11在所有其组中均未出现任何菌落,可能是由于酵母质粒提取不完整或转化大肠杆菌感受态未成功造成。25号蛋白beta actin重复性比较高,通过资料分析,beta actin为p-肌动蛋白,此蛋白有高度保守的基因序列,mRNA的表达数量高。常用于mRNA内标,在核酸酶保护分析中也可作为外标。推测p-肌动蛋白可能是猪附红细胞体与宿主互作蛋白中的重要蛋白。本试验为猪附红细胞体与宿主互作蛋白的深入研究以及猪附红细胞体病药物靶点的筛选奠定了基础。