论文部分内容阅读
锂盐(lithium)是一种疗效稳定的抗抑郁药。它对细胞增殖有抑制作用,并能降低恶性肿瘤发生的风险。虽然锂盐对肌醇一磷酸酶(inositolmonophosphatase,IMPase),糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3),以及一些磷酸酯酶的抑制作用已比较明确,但它的生物学作用的机制并未得到满意的解释。本课题以人肝癌细胞为主要研究对象,探讨了锂盐抑制细胞增殖的可能机制。首先,用MTT法检测了氯化锂对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的作用,结果显示它能显著抑制细胞增殖。流式细胞检测结果显示细胞发生了G2/M期阻滞,进一步的Giemsa染色证明细胞周期停滞于G2期。Western blot结果显示氯化锂能导致cdc2(Tyr15)发生显著磷酸化且程度与锂的剂量正相关。此外,p53,p21和cyclinBl的蛋白水平也有不同程度的提高。以上结果提示锂盐对细胞增殖的抑制与其诱导的细胞周期阻滞有关。接下来,本研究重点探讨了锂盐诱导G2期阻滞的机制。为明确p53是否参与了锂对周期的影响,我们用氯化锂处理表达野生型p53的HepG2细胞和p53缺失的Hep3B细胞,结果显示二者都发生了cdc2(Tyr15)磷酸化和G2/M期阻滞,且在程度上两种细胞之间无显著差别。锂盐能抑制GSK-3和IMPase的活性,对后者的抑制会导致细胞内肌醇耗竭。但GSK-3特异性抑制剂SB216763不能模拟氯化锂的作用,肌醇也不能削弱氯化锂对周期影响。此外,虽然氯化锂能使p38 MAPK发生磷酸化,但p38 MAPK的抑制剂未能消除氯化锂造成的G2期阻滞。以上结果提示锂盐对细胞周期的影响与GSK-3、IMPase和p38 MAPK活性无关,p53在其中的作用也不大。进一步的研究发现检测点激酶1(Chk1)参与了锂盐对细胞周期的作用。氯化锂诱导的G2期阻滞可被Chk1特异性抑制剂SB218078部分逆转,而且Chk1 siRNA,过表达kinase dead Chk1均有类似效果。氯化锂能诱导Chk1下游的cdc25C(Ser-216)发生磷酸化,体外蛋白激酶活性测定也显示氯化锂处理后的细胞Chk1活性有所提高。但氯化锂并不能使Chk1(Ser317,Ser345)发生磷酸化,提示它对Chk1的作用可能不通过经典的共济失调-毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasiamutated,ATM)/ATM和Rad3相关蛋白(ATM-and Rad3-related protein,ATR)途径实现。这一推断得到了一些间接的证明:一方面虽然Chk1抑制剂SB218078和ATM/ATR抑制剂咖啡因均可抑制羟基脲引发的cdc2磷酸化,但氯化锂的作用却只能被Chk1抑制剂逆转而不被ATM/ATR抑制剂逆转;另一方面过表达磷酸化位点突变的Chk1(S345A/S317A)对氯化锂的作用也无影响。以上这些结果表明:氯化锂至少部分通过Chk1诱导G2期阻滞,而且无需Chk1磷酸化。氯化锂诱导G2期阻滞的另一个途径是下调cdc25C磷酸酶。cdc25C负责cdc2(Tyr15,Thr14)的脱磷酸化。我们发现氯化锂能下调cdc25C mRNA水平及其蛋白水平,而且cdc25C蛋白水平和cdc2磷酸化在细胞周期过程中始终呈负相关。综上所述,锂盐对肝癌细胞的抑制与其诱导G2期阻滞有关,而周期阻滞的机制至少有两个:Chk1的参与是其中之一,下调cdc25C蛋白水平也是一种重要原因。考虑到锂盐在降低肿瘤发生风险方面的作用,因此彻底阐明锂盐对细胞周期作用的机制对肿瘤的预防和治疗将有积极意义。