CaMKⅡα基因在猴脑不同区域的特异性表达及其启动子分析

来源 :华东师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Keldorn
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多功能的钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅲ(CaMKⅡ)参与细胞内钙离子信号向下游多种通路的传递。CaMKⅡ可通过自身结构上的一段可变区的不同剪切产生不同的异构体的现象被认为与不同的功能实现有关。CaMKⅡ alpha亚型(CaMKⅡα)是在大鼠脑中特异并且大量表达的一种CaMKⅡ亚型,在学习和记忆机制中起着重要作用。为了分析CaMKⅡα在猴脑中的表达情况,我们运用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆了猴脑中存在的CaMKⅡα cDNA全编码序列。我们得到了五种CaMKⅡα异构体,其中包括两种在大鼠、人类中已经发现并研究的α、α_B和另外三种新的异构体α3、α3_B和α4。其中,α3、α3_B均在α、α_B基础上在结合区的可变区的C端又缺失了两个共171bp的外显子,而α4在α基础上在可变区的C端缺失了一个76bp的外显子。通过跨可变区设计特异性引物,在mRNA水平上的检测显示,这些新的异构体仅存在于猴脑中,而狗和大鼠脑中均不存在。我们分离了猴脑前脑皮层、海马、丘脑、上下丘和小脑各区,通过设计CaMKⅡα特异性引物和运用CaMKⅡα特异性抗体分别进行RT-PCR和western blot分析发现在mRNA水平,前脑皮层表达量最高,而在蛋白水平,丘脑中CaMKⅡα蛋白含量最高。结果揭示在猴脑中CaMKⅡα基因的表达也具有脑区特异性,同时也说明在间脑和中脑中特异表达的α_B的蛋白更稳定。 大鼠CaMKⅡα基因的启动子含有一个必须的TATA元件,细胞水平的功能测试显示该启动子在神经细胞中的活性远远高于在非神经细胞中的活性。为了分析人的CaMKⅡα基因启动子,我们建立了基于不同细胞株的启动子.报告基因测试系统。我们从人的基因组DNA中克隆出一段2047 bp的人CaMKⅡα基因启动子。DNA序列分析显示,人CaMKⅡα基因启动子不含TATA元件。我们构建了一系列5’侧翼或3’侧翼缺失的启动子片段和荧光素酶报告基因相连的的重组质粒,并用来转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和大鼠嗜铬神经瘤细胞PC12两种神经细胞株,及人神经胶质瘤细胞U251和人胚胎肾细胞HEK293两种非神经细胞株。报告基因测试结果显示人CaMKⅡα基因启动子在神经细胞中活性高于在非神经细胞中的活性。同时维甲酸(All-trans retinoic acid,简称RA)可以增强启动子在SH-SY5Y细胞中的活性。进一步分析显示在启动子的+11 to +136和
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