屎肠球菌的分离鉴定及其微囊化产品的制备和体外评价

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本实验的目的是开发两种饲用高活性的微囊化微生态制剂液态和固态剂型。通过筛选并鉴定4株生物学特性较好的屎肠球菌,采用发酵前包被工艺,对所筛选的菌株进行微胶囊化,通过对其工艺的改造,得到了液态和固态两种微囊化屎肠球菌剂型,并采用体外的研究方法对所得到的剂型进行了评价,得到如下结果:1.分别采用肠球菌选择性培养基(EC)从健康婴儿的粪便、健康仔猪的肠道及粪便中分离筛选了4株屎肠球菌,分别命名为EfB、Ef1-2、Ef3-4、Ef4-1,利用Biolog自动微生物分析系统鉴定,表明它们都是屎肠球菌;利用16S rRNA基因序列测序比较分析,表明这4株菌与数据库中已发表的屎肠球菌16S rRNA序列(Accession No.AY675247)同源性均为99%,两者鉴定结果一致。对其生物学特性进行研究,结果表明,所筛得菌株生长速度较快,在4小时就进入了对数增长期,并持续到14小时,14-18小时进入稳定期,18小时后进入衰亡期。它们对致病型大肠杆菌K88、K99、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌及沙门氏菌都有较强的抑制作用,抑菌圈直径为10-15mm,其中对大肠杆菌K99的抑菌效果最好,抑菌圈直径达为19-22mm。2.以海藻酸钠-氯化钙微胶囊体系采用前包被工艺进行屎肠球菌的固定化培养,活菌数比发酵后包被提高了两个数量级。采用1.5%的海藻酸钠浓度,100mMCaCl2和30min固化时间,所制得液态微胶囊形态好,粒径为1200±76μm;通过在培养基中加入0.2%的无水氯化钙,在电热鼓风干燥箱在45℃条件下烘5h,得到了色泽好,平均粒径为329μm,颗粒大小较均匀的微胶囊颗粒。当接种量扩大到3%时,得率提高了3倍,活菌数为11.06-1gCFU/g。3.对液态微囊化屎肠球菌剂型的特性进行了研究,结果表明微囊化培养的屎肠球菌对致病型大肠杆菌K88、K99、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌及沙门氏菌都有较强的抑制作用,抑菌圈直径为12-15mm,其中对大肠杆菌K99的抑菌效果最好,抑菌圈直径达到14.5mm。与游离培养状态下相比,微囊化培养的屎肠球菌具有更好的生长优势,更好的抵御高铜、模拟胃液的能力(P<0.01);储存实验表明在4℃条件下,储藏2个月,活菌数基本上没有下降。4.对固态微囊化屎肠球菌剂型的特性进行了研究,结果表明固态微囊化屎肠球菌产品与游离屎肠球菌产品相比具有更好的耐受80℃高温及模拟胃肠液的能力(P<0.01)。储存实验表明常温条件下,储藏2个月,活菌数基本上没有下降。显然,固态微囊化屎肠球菌产品也具有较好的抗逆特性,为今后的工业化生产奠定了基础。结论:分离鉴定了4株生长速度快,生物学性能较好的屎肠球菌。采用发酵前包被工艺得到了色泽好,粒径大小合适,颗粒均匀的且抗逆性与稳定性都较好的微囊化屎肠球菌液态与固态产品。显然,微胶囊包被能明显提高屎肠球菌在极端环境下的存活率,这为饲用高活性微生态制剂的开发提供了有价值的证据。
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