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研究目的:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶(sirtuin，SIRT)1是SIRT蛋白家族成员之一，调节细胞的增殖、分化、衰老、凋亡等多种生命活动。维持功能充分稳定发挥的负反馈机制称为功能内稳态。处于/远离功能内稳态的功能称为正则/失调功能。应激打破功能内稳态。正则/失调应激称为成功/慢性应激。从功能内稳态和应激的角度出发，本文主要研究了SIRT1在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞增殖和分化及其应激过程中的水平和活性的变化情况，初步了解SIRT1在正则功能和应激中所起的重要作用。 研究方法: 1.选择对数生长期的PC12细胞，根据培养温度和培养基中葡萄糖(glucose，Glu)和谷氨酰胺(glutamine，Gln)的浓度的不同将细胞分为六组:37℃+30 mMGlu+2mM Gln（对照组）;40℃+30 mM Glu+2Mm Gln（高温组）;37℃+30 mM Glu+0 mM Gln（无Gln组）;37℃+30 mM Glu+10 mM Gln（高Gln组）;37℃+10 mM Glu+2 mM Gln（低糖组）;37℃+90 mM Glu+2mM Gln（高糖组）。12h后酶循环法检测NAD+与其还原型(reduced form of nicotinamideadenine dinucleotide，NADH)的比值(NAD+/NADH)和蛋白免疫印迹法(Westernblotting，WB)检测SIRT1蛋白的表达水平，48 h后用噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide/Thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT)比色法检测细胞的增殖活性。 2.选择对数生长期的PC12细胞，根据培养基中Glu和白藜芦醇浓度的不同分为三组:25 mM Glu（对照组）;90 mM Glu（高糖处理组）;90 mM Glu+50μm白藜芦醇（正则功能对照组）。12h和72 h后WB法检测SIRT1蛋白表达水平，96 h后MTT比色法检测细胞的增殖活性。 3.选择对数生长期的PC12细胞，根据培养基中过氧化氢(H2O2)浓度和发光二极管阵列产生的640±15nm红光(red light at640±15 nm from light emittingdiode array, RLED640)光照的不同分为三组:对照组，H2O2组和H2O2+RLED640组。其中H2O2组和H2O2+RLED640组用终浓度为150μM的H2O2诱导细胞凋亡，H2O2+ RLED640组则进行RLED640光照刺激，照射方式为一次照射，照射强度为0.06 mW/cm2，照射时间为20 min。12h后酶循环法检测NAD+/NADH比值和WB检测SIRT1蛋白表达水平，48 h后MTT比色法检测细胞的增殖活性。 4.选择对数生长期的PC12细胞，并用含不同浓度神经生长因子(nervegrowth factor，NGF)的分化培养基（0、5、50、100、200和500 ng/ml）诱导细胞分化，96 h后检测细胞分化情况以及SIRT1和生长相关蛋白43(Growthassociated protein-43，GAP-43)蛋白的表达水平。 5.用浓度为50 ng/ml的NGF连续诱导PC12细胞分化4天后获得分化PC12细胞（differentiated PC12 cell，dPC12），将dPC12细胞随机分为三组，用所含NGF浓度分别为50、5和0 ng/ml的培养基继续培养，48 h后检测分化细胞数以及SIRT1和GAP-43蛋白的表达水平。 研究结果: 1.将PC12细胞置于六种不同条件培养48 h后，常规细胞培养条件(37℃+30 mM Glu+2 mM Gln)下PC12细胞的增殖活性最佳，处于增殖特异内稳态(proliferation-specific homeostasis，PISH)，属于正则增殖。细胞培养条件的各种改变都会引起应激，导致增殖显著下降，属于失调增殖，其中当Glu浓度度增加至90 mM时，细胞增殖能力最差。应激急性期(12h)，正则增殖的SIRT1的表达水平低于失调增殖。 2.高糖(90 mM Glu)处理PC12细胞96 h导致失调增殖，属于慢性应激。白藜芦醇的处理可以帮助高糖处理细胞重新建立正则增殖，实现成功应激。在应激急性期(12 h)，正则增殖（成功应激）的SIRT1的水平低于失调增殖（慢性应激）。在应激慢性期(72 h)，正则增殖（成功应激）的SIRT1的水平高于失调增殖（慢性应激）。无论是应激的急性期还是慢性期，白藜芦醇的处理均可以帮助高糖处理的PC12细胞将SIRT1表达调节至正则增殖的水平，从而达到完全康复细胞增殖的目的。 3.用150μM的H2O2处理PC12细胞48 h打破PC12细胞的P1SH，导致失调增殖，属于慢性应激。RLED640光照处理可以在一定程度上恢复细胞的增殖能力，但并未实现成功应激，仅仅是降低了应激程度。在应激急性期(12 h)，氧化应激升高SIRT1水平，RLED640的处理在一定程度上下调了SIRT1水平，但未恢复至正则增殖的水平。 4.NGF处理PC12细胞24 h，NGF浓度达到100-200 ng/ml时，细胞的分化程度最大，处于分化特异内稳态（Differentiation-specific homeostasis，DiSH），属于正则分化;更高或更低浓度的NGF引起慢性应激，属于失调分化。在应激慢性期(96h)，正则分化的SIRT1的水平高于失调分化，应激程度越高，SIRT1水平越低。 5.50 ng/ml NGF诱导PC12细胞分化4天属于失调分化，降低NGF的浓度继续培养48 h，可以维持细胞的分化状态;若完全撤除NGF，细胞开始去分化。在应激慢性期(48 h)，NGF浓度越低，SIRT1的水平越低。 研究结论:PC12细胞存在PISH和DiSH及其应激过程，SIRT1起到了重要的介导作用。在应激的不同阶段，SIRT1的作用截然不同。在急性期，正则功能的SIRT1水平低于失调功能，而且应激程度越高，SIRT1的水平越高。在慢性期，正则功能的SIRT1水平则高于失调功能，而且越远离正则功能，SIRT1的水平越低。