本课题中,我们利用前期真核表达的具有生物活性的人ICOSIg融合蛋白和构建的膜表达ICOS的CHO细胞株,研究ICOS是否向树突状细胞传递逆向信号及该逆向信号是否可以引起DCs相应功能的改变,进一步深入探讨ICOSL/ICOS通路信号传递的本质和内在机制,全面的了解ICOS/ICOSL配受体相互作用对机体免疫平衡调节的重要作用。 研究内容： 第一部分,主要研究前期构建的人ICOSIg与小鼠骨髓来源的树突状细胞体外特异性的结合、验证其生物学活性、研究可溶性ICOSIg蛋白本身对DCs的是否具有毒性作用,为后续研究ICOSIg与DCs表面ICOSL结合传递逆向信号的可行性提供实验依据。 第二部分,主要研究ICOSIg结合小鼠骨髓体外诱导培养第5天不成熟DCs表面ICOSL后,能否引起DCs相应的功能变化。检测指标包括:DCs表型分子的变化、DCs分泌细胞因子的变化、DCs吞噬功能改变、DCs抗原递呈功能改变、DCs对同种异基因T细胞刺激增殖能力变化。另外还利用体外构建的表达膜锚定ICOS的CHO细胞株,模拟体内细胞与细胞之间的相互作用,对可溶性ICOSIg蛋白的生物学功能进行验证。 第三部分,由于研究发现,针对共刺激分子另一家族成员PD-1配体PD-L2的抗体,作用于成熟DCs,可向DCs传递逆向信号,诱导产生了一种兼俱较强抗原摄取和抗原递呈功能并有成熟DCs表型的新的一类DCs细胞。我们也拟进一步研究ICOSIg作用于成熟过程中和成熟后的DCs,能否引起DCs的功能改变。 第四部分,由于体外研究缺少体内复杂环境因素相互作用的影响,我们借鉴文献建立皮肤过敏反应的动物模型,在体内进一步验证体外观察到的实验现象并进行相关机制的探讨。 实验方法： 采用流式细胞仪检测ICOSIg与其配体的特异性结合、实验处理后各DCs或T细胞表面分子的变化、胞内细胞因子变化、DCs的吞噬功能等；采用ELISA和实时荧光定量RT-PCR的方法检测各种培养上清中和培养细胞内的多种细胞因子、趋化因子、表面分子的表达变化；采用Annexin V/PI复染检测不同因素处理后细胞凋亡的变化；采用CCK-8检测可溶性蛋白对DCs细胞的毒性和促增殖作用；采用3H-TdR掺入检测DCs细胞抗原递呈功能和刺激异基因T细胞增殖能力；采用WesternBlot方法检测实验组表达p38总蛋白和磷酸化蛋白的表达情况；采用小鼠皮肤过敏反应的模型,体内验证ICOSIg的生物学功能。 实验结果： 第一部分,研究结果表明,体外诱导培养的DCs表面,有一定程度的ICOSL的表达,且ICOSL的表达随DCs细胞的成熟而逐渐下调。为了验证体外表达可溶性人ICOSIg与小鼠DCs特异性结合,我们先将DCs用CD16/32封闭,然后与ICOSIg或人IgG共孵育,再加入荧光标记抗人IgG二抗,可检测到ICOSIg与DC的结合,而对照IgG与DC无结合；为进一步验证其结合的特异性,我们用不同浓度的ICOSIg与PE标记的抗鼠ICOSL抗体同时作用于DC,结果发现抗ICOSL抗体与DC结合受到不同程度的阻断；如果先加入ICOSIg与DC共孵育,则ICOSIg可完全阻断抗鼠ICOSL抗体与DC的结合。同时借助于Annexin v/PI染色和CCK-8试剂盒,我们也发现ICOSIg处理过程中,DCs死亡或凋亡情况与对照组相比没有明显变化。同时,人源ICOSIg可在体外抑制不同品系小鼠脾脏单个核细胞的混合淋巴细胞反应,更表明其具有生物学活性。 第二部分,我们首先用可溶性ICOS蛋白与骨髓单个核细胞来源DCs(5天,未成熟)共孵育,检测培养上清细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ、TGF-β1表达。其中IL-2、IL-4低于试剂盒检测下限,ICOSIg不改变DCs分泌IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ、TGF-β1细胞因子的表达变化；而DCs表达IL-6水平随融合蛋白ICOSIg浓度的增加而明显上调。定量RT-PCR表明各实验组DCs表达TGF-β1,PGE2,CCL3,CCL4和CCL19无明显差异,但ICOSIg处理组IL-10有部分升高。与此同时,流式细胞仪检测表明ICOS处理组DCs表达共刺激分子CD83、CD80、CD86和Iab表达均比对照组有相应的提高,而ICOSL低于对照。进一步定量RT-PCR检测ICOSL mRNA水平结果表明,实验组和对照蛋白组ICOSL表达无明显差异。 第三部分,研究表明PD-L2的抗体可以向成熟DCs传递逆向信号,而我们及其他研究者均发现DCs成熟过程当中,ICOSL的表达量逐渐下调。那么ICOS能否向成熟过程中和成熟后的DCs传递逆向信号调节DCs的功能状态?我们在ICOSIg处理DCs的同时加入100ng/mL LPS或者是在加入100ng/mL LPS处理24h诱导DCs成熟后,再用ICOSIg处理DC24 h。结果LPS单独处理组DC分泌各种细胞细胞因子,除IL-2、IL-4,均比无LPS处理组明显升高,其表面分子的表达也明显增加,高于未刺激不成熟DCs。与对照组IgG相比,ICOSIg加LPS处理组DCs分泌TGF-β1的表达明显高于对照组,IL-10、IL-12 P40、IL-12 P70、TNF-α、IFN-γ等均无明显差别。ICOSIg+LPS组DC细胞各表面分子的表达也低于或类似于对照组。 第四部分,为了进一步在体内确证ICOSIg引起的DCs功能变化,我们采用皮肤过敏实验研究ICOSIg作用后的DCs调节细胞免疫功能的变化。用ICOSIg处理DCs,再用p815AB多肽和5μM破伤风毒素(tetanus toxin,tt)多肽冲击后,经尾静脉输入不同分组小鼠。2周后,诱发过敏反应。结果表明：(1)无处理和对照IgG1蛋白处理不成熟DCs体外经p815AB和tt刺激后,能引起轻度足垫皮肤过敏反应；而经过ICOSIg处理后,DCs能够诱发出明显的过敏反应,实验鼠左足重量明显增加；(2)若ICOSIg处理DCs细胞前先用足量抗ICOSL抗体封闭,则ICOSIg处理足垫过敏反应程度显著下调；(3)若在DCs与ICOSIg或IgG1孵育时加入抗IL-6阻断性抗体,则ICOSIg处理也不能引起典型足垫过敏反应。如在ICOSIg处理DCs的同时,加入LPS刺激,再进行体内实验,则各实验组DCs细胞均可诱发出明显的过敏反应,但对照与实验组之间无明显差异。抑制DCs中p38-MAPK通路进而抑制IL-6的分泌后,DCs诱导皮肤过敏反应的能力下调。 讨论： 共刺激分子家族成员配受体之间存在正反向信号的现象比较普遍。我们在本课题中致力于研究ICOS/ICOSL通路是否同样存在反向信号,并对该信号的性质作深入的探讨。以往研究用计算机模拟的方式,证明人和小鼠的ICOS结构相似,ICOS与配体ICOSL结合面关键氨基酸的序列也高度相似；我们的研究表明真核表达的人ICOSIg确实可以和小鼠DCs细胞表面ICOSL发生特异性结合,并具有生物学活性。进一步研究表明可溶性ICOSIg可以向不成熟DC传递逆向信号,引起骨髓来源不成熟DCs特异性分泌IL-6增加,同时DCs表型分子CD83、CD80、CD86和Iab表达均高于相应对照组。ICOS处理不成熟DCs后其吞噬和抗原递呈功能均增强,引起Th1细胞比例和功能增加,可在体内促进DCs调节的细胞免疫。然而,我们也发现如果在ICOSIg作用DCs过程中加入LPS或CpG诱导DCs成熟,则DCs分泌TGF-β1升高。由于LPS等因素刺激DCs成熟后,DCs分泌大量的促炎细胞因子如IL-6、IL-12、TNFα、IL-1β等,因此,尽管ICOS可以引起TGF-β1的部分增加,但其抑制免疫反应的功能作用有限,在体外仅引起DCs部分功能的改变,在体内则不能检测到明显的功能差异。然而也存在另外一种可能,因为ICOS仅在DCs成熟过程中促进其表达TGF-β1,而我们是在使用LPS和ICOSIg作用完毕后,收集细胞输注小鼠体内,此时,细胞已基本处于成熟状态,不同实验处理引起的DCs功能差异己接近消失,在这种情况下,皮肤过敏反应的模型可能并不能够真实反应DCs功能的改变,可能需要更好的模型来检测相关的功能变化。 通过本课题的研究,我们首次证明和其他部分共刺激分子一样,ICOS/ICOSL通路也存在反向信号；然而不同的是,随着环境因素的不同,ICOS可以通过同样的配体ICOSL传递不同的免疫信号：向不成熟DCs传递免疫刺激信号,诱导IL-6产生,增强机体的免疫反应；向成熟过程中的DCs传递免疫抑制信号,诱导TGF-β1表达,调节成熟过程中DCs细胞的功能状态。以往研究表明同一个配体可以通过不同受体传递不同信号,如PD-1通过其配体PD-L1和PD-L2可传递不同的信号；不同的配体也可以经过同一个受体传递不同的信号,如CCL19和CCL21结合CCR7、CD28/CTLA-4结合CD80/CD86;然而,像ICOS/ICOSL这种同一个配体通过同一个受体传递不同信号的方式却是首次证实,这也更表明免疫系统、免疫细胞之间相互影响、相互调控网络的复杂性。因此,ICOS可以通过DCs表面的ICOSL向不同成熟状态的DCs传递不同的信号,调节机体在不同状态下的免疫应答,这为进一步阐明ICOS/ICOSL通路在机体免疫调控中的作用以及针对该通路的靶向免疫治疗提供了新的思路。