母乳寡糖（Human milk oligosaccharides,HMOs）是母乳中具有多种生理活性,能够促进婴儿生长发育,提高其免疫力的重要营养物质。其中,乳酰-N-三糖Ⅱ（Lacto-N-triose,LNT II）是母乳寡糖中两类四糖,1型结构乳酰-N-四糖（Lacto-N-tetraose,LNT）和2型结构乳酰-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose,LNT）的骨架前体。因此,如何经济高效的工业化生产LNTⅡ正逐渐成为当前的研究热点。微生物细胞工厂（Microbial cell factories）法综合多种合成生物学和代谢工程手段,利用廉价且可再生的生物质原料绿色可持续地生产高价值化学品,是目前可用于规模化生产LNTⅡ的有效策略。本研究以甲壳素单体N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine,Glc NAc）作为碳源和供体底物,乳糖为受体底物,开发了一种以可再生资源微生物代谢发酵生产LNTⅡ的新方法,为未来进一步研究提供了理论支持。本文的研究内容主要包括:（1）首先以菌株Escherichia coli BL21（DE3）作为宿主构建了以Glc NAc为碳源和底物的LNT II代谢合成途径,探究了目标代谢通路相关酶的不同过度表达策略对产物积累的影响。实验结果显示,不表达乙酰氨基葡萄糖基转移酶（Lgt A）的菌株EHD01中没有LNTⅡ的积累,仅表达Lgt A菌株EHD02的LNT II细胞外滴度达到了0.12 g/L。在此基础上,构建了菌株EHD03（过表达Glm U和Lgt A）,EHD04（过表达Glm M、Glm U和Lgt A）和EHD05（过表达Glm M、Glm U、Nag A和Lgt A）,其滴度分别达到了0.24、0.60和2.44 g/L。摇瓶发酵实验结果表明同时增强三种酶的表达显著提高了LNT II的产量。（2）采用CRISPR-Cas9基因编辑技术对宿主进行改造。先后敲除了底物乳糖分解相关基因lac Z和代谢旁路基因nan E,得到宿主E.coli BL21（DE3）Δlac Z和E.coli BL21（DE3）Δlac ZΔnan E。同时在宿主中强化表达代谢通路的四个酶获得了菌株EHD07,EHD08和EHD09。通过摇瓶发酵实验验证敲除效果。结果显示EHD09相对于EHD07和EHD08的LNT II的滴度分别增加了105%和58%,表明lac Z和nan E的组合基因缺失更有利于LNT II的生产。（3）采用Gibson Assembly DNA分子克隆方法将LNT II合成代谢相关酶基因分别构建于不同拷贝数质粒上,并分别导入E.coli BL21（DE3）Δlac ZΔnan E中,构建24个菌株EHD09～EHD32并进行发酵。最终,菌株EHD29（包含质粒p RSFDuet-nag A-glm M、p ETDuet-glm U及p ETDuet-lgt A（CmR））的LNTⅡ滴度最高,达到3.70 g/L,乳糖的产率达到了0.618 mol/mol。（4）以菌株EHD29为出实验对象对摇瓶的发酵条件进行了优化,进行了不同诱导剂丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5 m M、1.0 m M、2 m M和3 m M）及不同诱导温度（20℃、25℃和28℃）的正交试验。最终LNT II最高滴度达到6.94 g/L,相对于初始产量提高了89%。在3 L发酵罐中进行分批补料发酵生产LNT II,发酵76 h后LNT II达到最大滴度,为15.8 g/L,OD600最高达到67.8。