芳香族氨基酸羟化酶及一氧化氮合酶在神经系统和内皮功能中有着重要的作用。四氢生物蝶呤(BH4)作为这些酶的重要辅助因子，其合成或再生障碍会导致神经递质的缺乏以及细胞内皮功能障碍。临床医学上把口服BH4作为治疗某些疾病的有效方法。然而通过化学方法合成BH4比较困难，以致经化工合成的BH4价格非常昂贵。墨蝶呤(SP)是一种昆虫内源性色素，大量沉积于黄体色家蚕突变体(lem)的幼虫体表。SP是经补救途径合成BH4的前体。为了开发高效低耗、程序简单、产量可观的BH4体外合成工艺，本研究开展了家蚕BH4补救合成途径相关酶，墨蝶呤还原酶(SPR)和二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因克隆、蛋白表达研究，并鉴定了两种酶的酶学特征。本实验首先将前期研究得到的重组质粒pET-24b/BmSPR转化至E. coli Rosetta(DE3)，用IPTG进行了不同浓度和不同时间的诱导表达，优化了蛋白的表达条件。SDS-PAGE电泳和Western Blot的检测结果表明家蚕SPR融合蛋白能够在原核表达系统中稳定表达。根据已公布的家蚕基因组精细图谱和EST等公共数据库的序列信息，我们设计特异性引物克隆出家蚕BmDhfr基因的cDNA序列，获得其ORF。该基因编码185个氨基酸残基，预测蛋白分子量约为21.1kD。将扩增的ORF片段连接至pET-24b表达载体，并诱导其原核表达，经免疫印迹检测确认家蚕DHFR在E.coli BL21(DE3)菌株中也得到了正确表达。用Ni-NTA亲和层析柱对BmSPR和BmDHFR重组蛋白进行纯化，经BCA法测定浓度后，对其酶活性进行分析。为进一步研究重组蛋白的最适反应条件，本研究通过改变底物浓度、反应时间、反应温度、反应液pH等因素，以观察酶活性的变化情况。分析结果表明重组BmSPR和BmDHFR分别对其底物SP和二氢叶酸有较好的催化活性。家蚕是重要的经济昆虫之一，并且日益成为基因工程的重要研究对象。本实验利用具有培养操作简单、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点的大肠杆菌表达系统，获得了纯度较高、有较好催化活性的BmSPR和BmDHFR重组蛋白。研究成果对于今后利用从家蚕lem突变体中大量提取的SP为底物，体外合成BH4的生物制药方面的应用基础研究具有重要意义。