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1、目的: 探索下调着丝粒蛋白E引起神经元样分化的PC12细胞凋亡的机制,以及与蛋白酶抑制剂协同作用下介导PC12细胞凋亡的途径,为研究PD发病机制提供理论依据。 2、方法: 运用RNA干扰技术,人工合成下调CENP-E的shRNA-CENP-E质粒,通过脂质体转染法进行转染。采用体外培养的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(adrenochromaffino,PC12)细胞株,经神经生长因子(NGF)诱导24小时形成神经元样分化的细胞。按照以下实验分组处理细胞: A组:空白对照组(PC12细胞); B组:空载体转染组(空载体转染PC12细胞); C组:shRNA-CENP-E载体转染组(shRNA-CENP-E载体转染PC12细胞组); D组:PD模型组(PC12细胞+lactacystin组); E组:空载体转染PD模型组(lactacystin+空载体转染PC12细胞组); F组:shRNA-CENP-E载体转染PD模型组(lactacystin+shRNA-CENP-E载体转染PC12细胞组)。 使用荧光定量PCR检测CENP-E在mRNA水平的表达、流式细胞技术检测细胞周期、蛋白印迹法检测Caspase-8、Caspase-9的表达。 3、结果: 1、荧光定量PCR结果显示:构建的shRNA-CENP-E质粒使PC12细胞中CENP-E mRNA水平较对照组明显降低(P<0.05),蛋白酶抑制剂诱导的PD细胞模型中CENP-E mRNA表达也较对照组明显降低(P<0.05)。 2、光镜下观察发现NGF能使PC12细胞长出突触,呈神经元样分化。流式细胞技术结果显示经NGF诱导后,大部分PC12细胞停留于G1期。lactacystin能使经NGF诱导分化的PC12细胞处于G1期的细胞比例较对照组减少(P<0.05)。 3、Western-blot结果提示下调CENP-E基因后使PD细胞模型中Caspase-9表达较对照组明显升高(P<0.05),但对Caspase-8的表达无明显影响。 4、结论: 1、RNA干扰技术能下调PC12细胞中的着丝粒蛋白E基因。 2、神经生长因子能使PC12细胞退出有丝分裂,分化为神经元样细胞。 3、蛋白酶抑制剂lactacystin能使神经元样分化的PC12细胞重启细胞周期。 4、在未经lactacystin诱导的PC12细胞中,CENP-E表达减少导致的细胞凋亡与线粒体途径及死亡受体途径无关。 5、在PD细胞模型中,CENP-E基因缺失与lactacystin协同作用,导致细胞凋亡,其机制可能是由于线粒体凋亡途径的激活。