脓毒症是一种危及生命的伴随器官功能异常的疾病,是由机体对抗感染时的功能异常响应导致的。脓毒症作为临床上一种常见的由感染引起的系统性炎症反应,通常由细菌感染引发,有时真菌、病毒以及寄生虫也可以引发,其死亡率高达30%-50%。脓毒症主要病理特征表现为肾脏、肝脏和肺脏受损,并伴随着肾脏细菌负荷的增加、血清中转氨酶及乳酸含量的显著上调。脓毒症的发展主要分为两个阶段,即早期的炎症反应阶段（SIRS）和后期的补偿性炎性抑制阶段（CARS）。SIRS阶段也被称为早期脓毒症。研究认为,在早期脓毒症时,上调炎性反应可能利于机体抗感染;而在后期的CARS阶段,很多患者由于无法及时缓解体内的炎性反应,可使得免疫细胞过量表达炎性细胞因子而引发“细胞因子风暴”,导致自身组织和器官衰竭,甚至死亡。因此,脓毒症的早期阶段是感染性疾病,而后期阶段可看作是一种自身免疫性疾病,对于这两个阶段就存在迥然不同的研究思路。值得注意的是,一些研究和临床调查都表明,脓毒症存在明显的性别差异,即女性不论是在感染后的严重程度还是死亡率都显著低于男性。虽然关于脓毒症性别差异的大部分研究主要关注染色体及基因的差异,但一些研究提示脓毒症的性别差异与雌雄体内不同激素的水平密切相关。雌性激素主要分为雌激素和孕激素两大类,其中雌二醇（Estradiol-β,E2）作为雌性一般状况下（未怀孕状态下）体内最主要的雌激素。可是,雌性抵抗早期脓毒症过程中E2的作用及其机制尚不清楚。机体免疫通常可以分为固有免疫和获得性免疫。2011年发现训练免疫是发生在固有免疫细胞,尤其是巨噬细胞中的一种新颖的免疫方式。当巨噬细胞受到首次抗原刺激（如β-葡聚糖）刺激后,其胞内会发生一系列的生物学变化,包括糖酵解的提高、表观遗传学变化以及AKT-m TOR信号通路的活化。当遇到第二次抗原刺激时（并不一定和第一次抗原种类相同）,巨噬细胞就会产生更迅速更强烈的免疫反应,从而帮助机体抵抗后来的更广泛种类的感染。提示训练免疫是促使机体固有免疫细胞获得类似获得性免疫中的“免疫记忆”能力,可以对更广泛的后续各种感染产生更及时更强烈的反应对抗感染。由于巨噬细胞在机体内对抗早期脓毒症感染时主要是通过分泌炎性细胞因子和吞噬病原菌起到保护的作用,在机体对抗细菌感染造成的早期脓毒症的过程中,训练免疫的发现可能提供了一条新颖的思路和治疗方法。可是,迄今关于训练免疫是否可以通过调控巨噬细胞极化或吞噬等以达到增强清除早期脓毒症感染病原菌能力的报道尚缺,而且E2是否参与及其在此过程中的作用也不清楚。通常可通过对小鼠进行肠道穿刺或者直接腹腔注射大肠杆菌或者革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖（LPS）建立脓毒症模型。为此,我们通过分别向雌性、雄性或者卵巢切除的C57BL/B小鼠腹腔注射β-葡聚糖、大肠杆菌或LPS建立小鼠训练免疫和脓毒症模型;同时在体外对巨噬细胞系RAW264.7和J774A.1以及骨髓来源的原代巨噬细胞（BMDMs）建立训练免疫和脓毒症模型。结果表明训练免疫后的雌性小鼠对脓毒症的抵抗力优于雄性,且这种优势与雌性小鼠体内远高于雄性的E2水平密切相关;分析并揭示了训练免疫后小鼠对抗脓毒症过程中的外周血巨噬细胞、巨噬细胞系及BMDMs的极化及其E2参与调控其极化的机制;考察了训练免疫的脓毒症模型中雌雄小鼠重要脏器中活性氧（ROS）和NADPH氧化酶2（NOX2）的表达情况;发现E2可通过上调NOX2-RUBICON信号通路促进巨噬细胞LC3B相关的吞噬（LAP）缓解早期脓毒症症状的机制。本研究不仅揭示了雌性抵抗早期脓毒症过程中E2的作用机制,而且也为临床上治疗男/女性早期脓毒症提供了新策略。研究疾病中不同性别的差异是精准医疗的重要基础性及前瞻性的研究,对理解机体生理过程及探讨个性化医疗方案都有着重要的意义。本研究的具体结果如下:1.雌性小鼠训练免疫后对抗早期脓毒症能力要优于雄性,且与其体内高水平的雌二醇含量密切相关:我们首先分别向十周龄雌/雄小鼠腹腔单独注射大肠杆菌或注射β-葡聚糖和大肠杆菌,以便建立雌雄小鼠脓毒症模型以及训练免疫脓毒症模型。通过观察及分析发现,不论是脓毒症模型还是训练免疫的脓毒症模型中,雌性小鼠主要脏器的损伤均明显小于雄性小鼠:雌性小鼠表征肺部损伤的HE切片医学评分优于雄性小鼠;雌性小鼠肾脏中大肠杆菌的负荷少于雄性小鼠;雌性小鼠血清中表征肝损伤的谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平低于雄性小鼠;雌性小鼠血清中作为脓毒症重要生物标志物的乳酸含量也低于雄性;雌性小鼠血清中雌二醇（E2）的含量均远高于雄性小鼠。这些结果表明,雌性小鼠比雄性小鼠对脓毒症具有较强的抵抗力。卵巢是体内产生并且分泌雌激素的最重要器官。为了确认E2在雌性小鼠对抗脓毒症中的作用,通过对六周龄雌性小鼠施行卵巢切除术获得卵巢切除（OVX）的小鼠,并在十周龄时建立训练免疫及脓毒症小鼠模型。结果表明:OVX小鼠血清中E2水平显著降低;OVX小鼠肺部损伤HE切片病理学评分显著低于雌性小鼠;OVX小鼠肾脏中大肠杆菌的负荷显著多于雌性小鼠;OVX小鼠血清中ALT和AST水平也显著高于雌性小鼠。这些结果表明,OVX小鼠在对抗脓毒症和在训练免疫后对抗脓毒症的过程中的能力均弱于雌性小鼠,提示小鼠体内的E2水平与其对抗脓毒症的能力密切相关。2.在训练免疫中雌二醇可通过促进巨噬细胞向M1型极化并抑制其向M2型极化对抗早期脓毒症:为了探究训练免疫通过调控巨噬细胞抵抗脓毒症的具体过程以及巨噬细胞在对抗感染时通过极化分泌炎性细胞因子杀伤病原菌的能力,我们分析了训练免疫的雌雄脓毒症小鼠模型的炎性细胞因子和巨噬细胞的变化。结果表明:雌性小鼠血清中IL-6和TNFα的水平均显著高于雄性小鼠;大肠杆菌组和训练免疫大肠杆菌组的雌性小鼠脾脏中CD11b+F4/80+巨噬细胞比例显著高于雄性小鼠;大肠杆菌组和训练免疫大肠杆菌组的雌性小鼠外周血单核细胞（PBMC）中F4/80+i NOS+的M1型巨噬细胞比例也显著高于雄性小鼠;相反,上述雌性小鼠PBMC中F4/80+CD206+的M2型巨噬细胞比例显著低于雄性。这些结果显示,在抵抗早期脓毒症中雌性比雄性小鼠的巨噬细胞不仅较多的聚集于脾脏,而且显著向M1型极化并且更大量地表达和分泌促炎性细胞因子,同时M2型抑制炎症反应的巨噬细胞比例也显著降低。为确认E2在上述巨噬细胞极化中的作用,我们检测了雌性和OVX小鼠血清中炎性细胞因子和PBMC中巨噬细胞的变化。结果表明OVX小鼠血清中IL-6和TNFα的含量显著低于雌性小鼠,而OVX小鼠PBMC中F4/80+CD206+的M2型巨噬细胞比例显著高于雌性小鼠。体外实验中,通过在雌雄小鼠BMDM中建立训练免疫及脓毒症模型,模型中的LPS组和训练免疫LPS组中,雌性小鼠F4/80+i NOS+M1型BMDM比例远高于雄性小鼠,而雌性小鼠F4/80+CD206+M2型BMDM比例显著小于雄性小鼠。通过向上述模型中加入50n M的E2,结果表明在训练免疫的基础上E2可进一步活化训练免疫信号分子表达,上调IL-6和TNFα表达,显著增加F4/80+i NOS+M1型BMDM比例,以及降低F4/80+CD206+M2型BMDM的比例。另外,我们利用巨噬细胞系RAW264.7和J774建立了训练免疫的感染细胞模型,结果也表明E2可进一步上调炎性细胞因子TNFα和IL-1βm RNA水平的表达。这些结果提示在训练免疫中E2可通过促进巨噬细胞向M1极化并抑制其向M2极化抵抗早期脓毒症的发生及发展。3.雌二醇通过抑制Rel B入核调控训练免疫中巨噬细胞的极化:已有研究报道NFκB信号通路与巨噬细胞的炎性细胞因子表达及极化密切相关;NFκB家族的重要转录因子—Rel B的入核可上调M2型巨噬细胞相关基因的表达。我们的结果表明,E2可显著下调RAW264.7细胞系IL-10和IL-4m RNA的合成;在敲低雌激素受体α（ERα）的表达后,E2对IL-10和IL-4的抑制作用即被消除。通过免疫荧光和检测RAW264.7细胞核中的Rel B蛋白水平发现,E2可抑制Rel B入核,但对P65的分布没有影响,且E2显著降低RAW264.7细胞核中Rel B的蛋白水平;敲低RAW264.7细胞的ERα后,其细胞核中Rel B的蛋白水平恢复。这些结果说明E2可通过ERα抑制Rel B入核进而调控巨噬细胞的极化。4.雌二醇通过NOX2-RUBICON信号通路促进训练免疫的巨噬细胞LAP对抗早期脓毒症:在对抗脓毒症时,巨噬细胞不仅可通过向M1极化和分泌炎性细胞因子杀伤病原菌,而且还可通过自噬吞噬病原菌及上调ROS产生进而杀伤并消化病原菌。巨噬细胞中ROS及产生ROS的NOX2是巨噬细胞非经典自噬LAP（LC3B-associated phagocytosis）的重要信号分子。为了分析E2和训练免疫对小鼠巨噬细胞LAP的影响,我们检测了小鼠训练免疫脓毒症模型中巨噬细胞LAP的变化。结果表明,LPS组和β-glucan+LPS组雌性小鼠的ALT和AST水平均显著低于雄性小鼠;训练免疫大肠杆菌组雌性小鼠肺脏和肝脏中ROS水平显著高于雄性小鼠;大肠杆菌组和训练免疫大肠杆菌组的雌性小鼠肺脏、肝脏和肾脏中吞噬细胞数量及NOX2的表达均显著高于雄性小鼠。进一步发现OVX小鼠的肺脏和肝脏ROS水平显著低于雌性小鼠,且OVX训练免疫大肠杆菌组小鼠肺脏、肝脏和肾脏中吞噬细胞数量及NOX2表达水平也显著低于雌性小鼠。体外实验也证实,E2可上调训练免疫的RAW264.7和J774A.1细胞系中吞噬大肠杆菌颗粒数量、过氧化氢及ROS水平;E2也在上调巨噬细胞系中NOX2亚基gp91phox,p47phox的同时,降低降解ROS的酶类SOD1、GPX1、GPX2及Catalase的m RNA水平。然而,在体内外训练免疫脓毒症和感染细胞模型中加入NOX2抑制剂DPI时,小鼠脓毒症抵抗力及巨噬细胞系的吞噬能力显著被抑制。我们还发现,E2可上调训练免疫的RAW264.7、J774A.1及BMDM等巨噬细胞ROS产生、吞噬能力及LAP相关蛋白的表达及其共定位;E2可通过ERα上调RUBICON表达及巨噬细胞系的吞噬能力,而沉默ERα则上调效果消失,但沉默ERβ不影响该上调效果。这些结果表明,E2在抵抗早期脓毒症中的作用是通过ERα上调训练免疫中巨噬细胞NOX2-RUBICON介导的LAP过程而实现的。综上所述,本研究（1）确认雌性小鼠训练免疫后对早期脓毒症抵抗力优于雄性小鼠,且与其体内E2的高水平正相关;（2）发现在训练免疫中E2可通过促进巨噬细胞向M1型极化而抑制其向M2型极化对抗脓毒症的发生及发展;（3）阐明E2可通过抑制Rel B入核调控巨噬细胞极化的机理;（4）揭示E2可通过ERα上调训练免疫中巨噬细胞NOX2-RUBICON介导的LAP过程进而抵抗早期脓毒症的机制。本研究可增强对E2在雌性小鼠抵抗早期脓毒症过程中的作用理解,也可为临床治疗男/女性早期脓毒症提供新的思路。