蚜虫巴克纳氏菌(Buchnera aphidicolia)是蚜虫体内的主要共生细菌。巴克纳氏菌与蚜虫(Buchnera-Aphid)之间的共生关系是细菌与真核生物共生演化得最完美、最和谐的例子。对二者在生理生化乃至分子水平上相互作用的探讨将为生物界的协同进化规律提供重要启示;对这种共生关系的研究,还可以为蚜虫的生物防治及蚜虫传毒的控制提供新的思路。到目前为止,国内未见相关研究报道。黑豆蚜(Aphis craccivora)是豆科作物的主要害虫,对于黑豆蚜是否存在胞内共生细菌及其对寄主蚜虫有什么作用,亦未见有研究报道。本论文主要从以下四个方面对黑豆蚜与巴克纳氏菌共生体系进行了研究。1. 共生菌在黑豆蚜生长和繁殖中的作用研究蚜虫与细菌的共生关系,首先要获得脱共生蚜虫。本研究用五种抗生素以不同的方式处理黑豆蚜,通过蚜虫的生长发育和繁殖情况了解抗生素的作用效果。结果表明,将2mg/ml的抗生素喷洒在接有1日龄若蚜的蚕豆苗上,或在豆苗上喷洒抗生素24小时后再接入1日龄若蚜,土霉素处理使若蚜发育延长2-3天,成蚜个体缩小50%以上,完全不能生育;氯霉素和金霉素处理的若蚜发育期延长1-2天,成蚜个体缩小50%左右,产子数下降了68%-98%;青霉素和链霉素对黑豆蚜影响较小,除产子数显著下降外,发育和成蚜大小基本未受显著影响。将抗生素直接喷在1日龄若蚜体表的处理方法对蚜虫影响很小。将豆苗浸在含有0.2mg/ml抗生素溶液中的作用效果与喷洒2mg/ml抗生素的效果相似。由于全纯饲料本身对蚜虫生长发育的影响很大,向人工饲料中添加0.05mg/ml的抗生素后,黑豆蚜的生长繁殖更加困难,无法获得具有研究价值的脱共生蚜虫。本项研究表明,将抗生素喷洒在虫体和植株表面或将植株浸在抗生素溶液中饲养蚜虫,是获得脱共生黑豆蚜最方便有效的方法。 <WP=8>2.黑豆蚜脱共生的分子诊断蚜虫脱共生效果的鉴定对Aphid-Buchnera共生体系的研究至关重要,目前国内外尚无直接鉴别蚜虫脱共生效应的方法。根据巴克纳氏菌rRNA操纵子中编码23SrRNA的基因rrl 与aroE基因紧密相邻的分子结构特点,利用已经测定的巴克纳氏菌rrl-aroE基因序列设计引物,进行特异性PCR扩增,根据扩增结果可以较准确地鉴定巴克纳氏菌的存在与否。研究结果表明,在各种抗生素处理5 天后均有巴克纳氏菌特异性扩增条带,说明共生菌仍然存在。在各种抗生素处理10天后,只有土霉素和利福平处理的蚜虫没有特异性扩增条带,其它几种抗生素处理的蚜虫仍存在特异性条带,这说明在土霉素和利福平处理10天后,蚜虫胞内共生细菌的核酸已经被降解。透射电镜检测结果表明,利福平处理7天后可以观察到蚜虫胞内共生细菌细胞壁受损和核物质被降解的情况,这一观察结果与PCR检测结果相一致。3.共生菌对黑豆蚜体内总蛋白质和游离氨基酸代谢的影响为了解共生菌对黑豆蚜蛋白质和氨基酸代谢的影响,用利福平处理黑豆蚜以除去其胞内共生菌,产生脱共生蚜虫。与未经抗生素处理的正常蚜虫相比,7日龄时,脱共生蚜虫每毫克鲜重的总蛋白含量降低了29%,每毫克鲜重的游离氨基酸含量提高了17% 。对黑豆蚜取食的蚕豆苗韧皮部组织中必需氨基酸所占的比例进行分析后发现,蚕豆苗韧皮部组织中的必需氨基酸含量仅占20%,而有共生菌的黑豆蚜组织中必需氨基酸已达到44%,脱共生后降低到37%,这些结果证明了黑豆蚜的胞内共生菌为其寄主提供了部分必需氨基酸。通过对游离氨基酸组成的分析发现,在共生和脱共生蚜虫中,必需和非必需氨基酸的比例分别为1∶1.16和1∶1.26,无显著差异。但在测定的17种氨基酸中,必需氨基酸中的苏氨酸在共生蚜虫中所占的比例为21.6%,在脱共生蚜虫中仅为16.7%。同样,非必需氨基酸中的天冬氨酸,在共生蚜虫中仅占总氨基酸的5.3%,而在脱共生蚜虫中却高<WP=9>达38.5% 。这些结果表明,各种氨基酸比例的失调,造成了脱共生蚜虫蛋白质合成受阻和部分游离氨基酸的积累,并因此导致蚜虫发育失调。4.黑豆蚜胞内共生菌对日本柄瘤蚜茧蜂发育和繁殖的影响日本柄瘤蚜茧蜂是黑豆蚜的优势内寄生蜂。研究表明,日本柄瘤蚜茧蜂在脱共生黑豆蚜体内可以完成发育周期,但幼虫期、预蛹期和蛹期显著延长,卵期和成蜂寿命无显著变化;幼虫和成蜂的个体均显著变小;羽化率降低了13%;雌蜂产卵量下降了25%。对黑豆蚜总蛋白和游离氨基酸的测定结果表明,平均单头脱共生蚜虫较共生蚜虫的总蛋白含量低85%左右,游离氨基酸量低70.8%;被寄生后,脱共生蚜虫较共生蚜虫的总蛋白含量低84%左右,游离氨基酸量低64%。由此可见,不论寄生与否,每头脱共生蚜虫的总蛋白和游离氨基酸含量均明显低于共生蚜虫,这主要由于蚜虫被脱去共生菌后个体显著变小的缘故。但是,在这样的一头蚜虫体内,日本柄瘤蚜茧蜂仍能完成个体发育,羽化率仍达到了80%以上,并产出相当数量的正常卵。