研究背景及目的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM),是一种独立于冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压及瓣膜性心脏病、酒精性心肌病之外的表现为弥漫性心肌病变的糖尿病心血管并发症,组织形态学异常主要表现为心肌纤维化、细胞外基质中胶原沉积、细胞外基质胶原构型的改变,即细胞外基质(extracellular matrix, ECM)重构。以往对ECM病理变化的研究主要集中在心肌细胞上,心肌间质纤维化在ECM发病机制中的研究近年来越来越受到重视。胶原蛋白是心肌间质中占重大比例的成纤维细胞分泌的。成纤维细胞占心脏非心肌细胞的90%-95%,其主要功能包括(1)分泌细胞因子及生长因子,包括IL-1、IL-6、TNF-α和TGF-β等；(2)分化为肌成纤维细胞,肌成纤维细胞合成分泌一些趋化因子,招募炎症细胞,使其侵袭性更强； (3)增殖和迁移；(4)影响细胞外基质的分泌和降解,主要通过调节基质金属蛋白酶(Matrix Metallo Preteinases, MMPs)-基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)的平衡实现。心脏成纤维细胞以上述各种活动参与各种刺激(包括高糖刺激)的应答,所以心脏成纤维细胞在DCM的心肌重塑中发挥重要作用。但是目前引起DCM的心肌重塑的具体分子机制仍然不明确,所以研究DCM的病理新机制,寻找新的作用靶点,具有重要的理论及临床意义。肌细胞增强因子2 (MEF2)是一种转录调节因子,在脊柱动物中MEF2家族成员包括四种转录因子MEF2A. MEF2B、MEF2C、MEF2D,在成人心脏中主要表达MEF2A和MEF2D。MEF2A基因位于染色体15q26区间,其编码的转录因子,在调节成肌细胞分化相关基因的表达中发挥重要作用。研究发现过表达MEF2A的转基因小鼠出现扩张性心肌病的表现,其与调节ECM相关的基因有关。在糖尿病大鼠的肾脏及视网膜中MEF2A的表达增加。在高糖预处理的心肌细胞及糖尿病大鼠的心脏组织中,MEF2A表达和对照组比较明显增加。以上说明MEF2A在糖尿病心肌病的发病中发挥着一定的作用,但以前的研究大都集中于MEF2A对心肌细胞的影响,进而引起心脏结构及功能的变化。MEF2A对占心肌间质主要成分的心脏成纤维细胞的影响尚未有报道,所以本实验研究MEF2A干扰对高糖状态下成纤维细胞增殖、迁移、向肌成纤维细胞转化、对MMP-TIMP平衡及胶原分泌的影响。由此我们提出假说,在高糖状态下MEF2A可能通过调节成纤维细胞的活动,比如增值、迁移、向肌成纤维细胞转化,MMP-TIMP平衡及胶原分泌等,影响DCM的心肌重构病理发展过程,为DCM的治疗提供新的治疗靶点。研究目的1.研究MEF2A在心脏成纤维细胞中的表达情况,观察高糖导致的MEF2A表达及定位的变化。2.探讨MEF2A干扰对高糖诱导的心脏成纤维细胞增值、迁移、向肌成纤维细胞转化、胶原合成能力及基质金属蛋白酶活性(MMP)-组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)平衡的影响。3.探讨MEF2A对高糖状态下的心脏成纤维细胞产生影响的作用机制。研究方法1.慢病毒shRNA-MEF2A载体构建设计3对MEF2A基因的shRNA质粒,用RT-PCR和蛋白印迹法分析干扰效率,选择干扰效率最高的序列装载包含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的慢病毒载体。MEF2A的目标干扰序列(ShRNA-MEF2A)为：5’-GCTTGCCACCTCAGAACTTCT-3’,阴性对照序列(shRNA-NC)为：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。2.心脏成纤维细胞培养及干预从1至3天新生小鼠心室组织中提取心脏成纤维细胞,并用梯度贴壁法纯化,用免疫荧光检测Vimentin以评估其纯度,免疫荧光检测VWF排除内皮细胞的污染。以正常糖浓度及相同渗透压培养的细胞为对照,应用不同时间(6h、12h、24h、 48h、72h)的高糖刺激细胞,观察其MEF2A的表达。ShRNA-MEF2A慢病毒载体转染细胞后再加高糖干预,观察其对心脏成纤维细胞各种应对功能的影响。3.细胞免疫荧光应用细胞免疫荧光检测成纤维细胞中MEF2A及磷酸化的MEF2A(p-MEF2A)、β平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的分布及表达。4.蛋白印迹(Western blot)收集各组心脏成纤维细胞,提取蛋白,分别检测MEF2A, p-MEF2A, α-SMA、胶原1 (collagen I)、胶原III (collagen III)、MMP2及MMP9,金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP1)及TIMP2、TGF-β1、p38MAPK、p-p38 MAPK、JNK、 p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、Akt、p-Akt和β-actin的蛋白表达情况。5.实时定量逆转录PCR(RT-PCR)收集心脏成纤维细胞,提取RNA,进行逆转录及RT-PCR,检测各组细胞中MEF2A的mRNA表达水平。6.成纤维细胞增殖检测用CCK-8及Cell-LightTMEdU方法检测经shRNA-MEF2A’陧病毒载体转染及高糖干预后细胞的增殖。7.成纤维细胞凋亡检测用PE-Annexin V凋亡检测试剂盒检测经shRNA-MEF2A慢病毒载体转染及高糖干预后细胞的凋亡情况,以排除成纤维细胞凋亡对增殖检测的影响。8.成纤维细胞迁移检测用划痕实验及Transwell小室两种方法检测经shRNA-MEF2A’慢病毒载体转染及高糖干预后细胞的迁移。9.明胶酶谱用明胶酶谱法检测经shRNA-MEF2A慢病毒载体转染及高糖干预后各组心脏成纤维细胞上清液中MMP2及MMP9的活性。10.统计学分析SPSS16.0软件用于处理分析数据,所有数据用均数±标准差(Mean±SD)来表示,不同组间比较用方差分析,组间两两比较用Tukey分析。研究结果1.高糖使心脏成纤维细胞中MEF2A表达增加,并使MEF2A由细胞核向细胞浆转位。与正常糖对比,33 mM高糖刺激心脏成纤维细胞,MEF2A表达6h升高,48h达高峰。渗透压组及对照组无明显变化。免疫荧光及Western blot检测显示,高糖使MEF2A表达从细胞核向细胞浆中转移,而p-MEF2A始终存在于细胞核中,但表达增高。2. MEF2A抑制减少高糖导致的成纤维细胞增殖,而对凋亡无影响CCK-8检测显示,与高糖组比较,MEF2A抑制明显抑制各个时间点上高糖导致的成纤维细胞增殖。细胞增殖核标记物EdU染色检测心脏成纤维细胞经shRNA-MEF2A’慢病毒载体转染及高糖干预48h后增殖情况,结果也显示高糖组较对照组及OC组细胞增殖增加,而MEF2A干扰使高糖诱导的细胞增殖明显减轻。流式细胞仪检测证实MEF2A抑制没有影响成纤维细胞的凋亡。3. MEF2A抑制限制高糖导致的成纤维细胞迁移划痕实验检测MEF2A慢病毒转染后高糖干预12h、24h、36h、48h后心脏成纤维细胞的迁移情况,Transwell检测MEF2A’慢病毒转染后高糖干预48h后迁移至小室的心脏成纤维细胞数量,两者结果都显示：与对照组比较,高糖明显增加成纤维细胞的迁移,与高糖组对比,MEF2A抑制明显减少高糖导致的成纤维细胞迁移。4. MEF2A抑制减轻高糖诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化α-SMA是肌成纤维细胞区别成纤维细胞的标记物,本实验用Western blot和免疫荧光检测α-SMA的经MEF2A干扰和高糖处理后表达及定位的变化。结果显示：与对照组比较,高糖干预使成纤维细胞中表达α-SMA升高,而与高糖组相比,MEF2A抑制使高糖诱导的α-SMA增加减轻。5. MEF2A调节高糖导致的成纤维细胞内MMP-TIMP平衡紊乱和胶原分泌MMP-TIMP平衡对调节细胞外基质合成和降解起重要作用。Western blot检测成纤维细胞内MMP和TIMP的表达,结果显示：与两对照组比较,高糖使MMP2及MMP9的表达增加,而MEF2A病毒干扰使高糖导致的MMP2和MMP9的表达升高减轻。但Western blot检测TIMP1和TIMP2的表达变化,各组间无明显差别。明胶酶谱法检测成纤维细胞培养液中MMP2和MMP9的活性变化,即成纤维细胞分泌至细胞外的MMP2和MMP9的活性情况,结果显示：与对照组比较,高糖使MMP2和MMP9的活性升高,而MEF2A病毒干扰使高糖导致的活性升高减轻。Western blot检测成纤维细胞内胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达。结果显示：与对照组比较,高糖使成纤维细胞内胶原Ⅰ及胶原Ⅲ表达增加,而MEF2A抑制减少高糖诱导的胶原Ⅰ及胶原Ⅲ的表达增加。6. MEF2A抑制减轻成纤维细胞内高糖导致的Akt和TGF-β1/Smad信号通路的激活为探讨MEF2A抑制影响成纤维细胞的活性的机制,Western blot检测信号通路上MAPKs、Akt、TGF-β1和Smad2/3表达变化。结果显示：和正常糖和渗透压对照组比较,高糖使成纤维细胞内MAPKs、Akt、TGF-β1和Smad2/3表达增加。MEF2A抑制使p-p38表达进一步增加,使Akt和TGF-β1/Smad表达降低,对ERK1/2和JNK的表达变化无明显影响。研究结论1.高糖使心脏成纤维细胞中MEF2A表达增加,并向细胞质弥散,使p-MEF2A表达增加。2. MEF2A抑制减轻高糖诱导的成纤维细胞增值、迁移、向肌成纤维细胞转化、MMP-TIMP平衡及胶原分泌。3.下调MEF2A抑制高糖诱导的成纤维细胞功能改变的机制可能与抑制Akt和TGF-β1/Smad信号通路相关。研究背景糖尿病能够影响心脏结构和功能,在没有动脉粥样硬化和高血压的情况下导致心衰,这被称为糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy, DCM)。DCM是糖尿病患者发病率和致死率升高的主要原因,心肌纤维化是DCM患者末期的主要病理变化,但其具体机制尚不清楚。随着糖尿病患者心衰发病率增加,探索DCM发病机制和更好的治疗方法具有重要意义。有研究显示内皮向间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)在心肌纤维化中有重要作用。EndMT是内皮细胞向间充质细胞转分化的过程,在此过程中,内皮细胞黏附性丢失、极性改变并伴随内皮标记物表达降低,间充质标记物表达升高。EndMT可以通过MEK、PI3K、p38MAPK等信号通路被TGF-β2激活,抑制这些信号通路可以阻止EndMT的发生。近来,大量研究显示高糖可以刺激EndMT发生,但具体的分子机制尚不明确。肌细胞增强因子2A属于转录因子家族,在心血管系统的胚胎发育和细胞增殖、分化及死亡中发挥重要作用。MEF2A在内皮细胞中表达,并和血管新生密切相关,其表达模式和血管内皮生长因子2和血管性假血友病因子相似。有研究显示骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)、Smad2、p38MAPKs、ERK5和MEF2A有相互作用,而这些蛋白是调节EndMT信号通路的关键分子。因此,我们假设MEF2A部分通过调节高糖诱导的EndMT参与糖尿病患者心脏纤维化的发生发展。为了证实我们的假设,我们设计了一系列体内外实验。研究目的1.研究MEF2A对高糖诱导的EndMT的影响；2.探讨MEF2A调节高糖诱导的EndMT的分子机制。3.体内研究MEF2A对糖尿病导致的心脏纤维化及心脏功能的影响。4.体内研究MEF2A敲除对心脏内皮细胞EndMT的影响。5.探讨MEF2A是否通过调节EndMT影响糖尿病心肌病的纤维化及心脏功能。研究方法1.构建慢病毒介导的MEF2A干扰载体慢病毒载体包括绿色荧光蛋白报告基因和MEF2A干扰的短发卡结构。2.细胞培养及鉴定：采用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为研究对象；细胞免疫荧光检测内皮标记物CD31和VE-Caderin的表达鉴定培养细胞是否为HUVECs。3.细胞内基因干预：体外实验,以33 mmol/L右旋葡萄糖刺激,5 mmol/L葡萄糖作为对照,观察HUVECs在高糖状态下的反应。采用慢病毒转染MEF2A shRNA的方式抑制MEF2A的基因表达；用p38MAPK抑制剂预先处理,抑制p38MAPK磷酸化；应用瞬时转染Smad2-siRNA的方式抑制Smad2的基因表达。4.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, CO-IP)CO-IP检测HUVECs内MEF2A和Smad2在高糖状态下的相互作用。5. Duolink原位-邻位链接技术检测Duolink原位-邻位链接技术检测HUVECs内MEF2A和Smad2在高糖状态下的相互作用。6.动物模型的建立及干预：C57BL/6J小鼠采用腹腔注射链脲菌素(STZ)建立1型糖尿病模型。小鼠注射柠檬酸缓冲液作为对照组,1周后测量血糖,随机血糖>20mmol/L的小鼠被认为建模成功。继续喂养12周后,模型组小鼠随机分为3组：单纯糖尿病组(DM),糖尿病加shRNA-NC干预组(DM+shRNA-NC),糖尿病加shRNA-MEF2A干预组(DM+shRNA-MEF2A).小鼠心脏内慢病毒转染采用心肌局部注射的方法,2X107 UT/30μL慢病毒或对照溶液分别选择3个不同的位置注入左心室壁中。继续喂养4周后将动物实施安乐死后取材。7.心脏功能检测用经胸超声心动图测量心脏功能,采用二维、M超、脉冲多普勒及组织多普勒超声成像技术检测心脏功能参数,评估心脏收缩舒张功能。8.心脏内皮细胞分离心脏单个细胞由组织单细胞分离器从心脏组织中分离出来,内皮细胞用包被CD146抗体的磁珠进行阳性分选,从而得到心脏内皮细胞。9.组织学分析心脏切片进行Masson染色和天狼猩红染色,并对心脏间质及血管周围的纤维化程度进行定量分析,以评估MEF2A干扰及高糖干预对纤维化的影响。10.免疫组织化学免疫组化分析心肌中胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达情况。11.细胞荧光免疫和组织荧光免疫组化：细胞荧光免疫组化显示细胞内的MEF2A、CD31、VE-cadherin、FSP-1、α-SMA、 p38MAPK及Smad2的表达,组织荧光免疫组化显示心肌组织中CD31、S100A4和α-SMA的表达变化。12. SYBR Green实时荧光定量PCR分析SYBR Green RT-PCR分析心肌组织中MEF2A mRNA表达变化及心脏提取的内皮细胞中CD31, VE-cadherin, FSP-1和α-SMA等标记物mRNA表达变化。13.Western blot分析Western blot分析心脏组织及HUVECs细胞中MEF2A、CD31、VE-Cadherin S1004A/FSP-1、vimentin、α-SMA、p38MAPK、phospho-p38MAP、Smad2、 phospho-Smad2等的变化。14.统计分析所以数据用平均数±标准差表示,多组间比较用方差分析,p<0.05被认为有统计学意义。研究结果1. HUVECs细胞鉴定及MEF2A慢病毒干扰效率评估细胞免疫荧光显示所有细胞CD31均呈阳性,证明所培养细胞为HUVECs.绿色荧光蛋白(GFP)代表其转染效率达95-6以上,RT-PCR及Western blot分别分析其干扰效率达30%以上。2. MEF2A干扰抑制HUVECs高糖诱导的内皮-间充质转化(EndMT)HUVECs转染病毒后经高糖干预,显微镜下观察细胞形态变化显示：高糖使细胞有圆形或椭圆形向长梭形转变,而MEF2A干扰阻止高糖诱导的这种形态改变发生。免疫荧光检测显示高糖明显增加FSPI和α-SMA等间充质标记物表达,而使内皮标记物CD31和VE-Cadherin等内皮标记物表达减少,并且可以观察到CD31和FSP1, CD31和α-SMA同时表达的细胞,而MEF2A干扰使这种高糖诱导的标记物表达变化减轻,使内皮及间充质标记物同时表达的阳性细胞数减少。Western blot结果和免疫荧光结果相一致：高糖使CD31和VE-Cadherin表达降低,FSP1、α-SMA和vimentin表达升高,MEF2A干扰使高糖诱导的各标记物变化减轻。3.HUVECs中高糖导致的EndMT受MEF2A向胞浆转位和与p38MAPK和Smads相互作用的调节免疫荧光和Western blot分析显示高糖使MEF2A在HUVECs的胞浆中表达增加,对p-MEF2A的定位无影响,使表达增加。Western blot检测显示用SB203580阻止p38的磷酸化可以减少高糖诱导的MEF2A, p-MEF2A和EndMT标记物的表达变化。CO-IP检测显示MEF2A和Smad2之间存在相互作用。而PLA显示MEF2A和Smad2的相互作用在对照组发生在细胞核内,在高糖组中发生在细胞浆中。Western blot分析显示,与对照组比较,高糖增加Smad2的磷酸化水平,而MEF2A干扰使其高糖诱导的磷酸化水平降低。Smad2被si-RNA干扰后,高糖诱导的MEF2A、FSP-1和α-SMA表达降低,CD31和VE-Cadherin表达升高。4.心肌内注射shRNA-MEF2A干扰病毒使糖尿病小鼠心肌中MEF2A表达降低RT-PCR和western blot分析评估对照组及糖尿病小鼠经慢病毒转染干扰后MEF2A mRNA和蛋白的表达情况。MEF2A干扰组较干扰对照组mRNA和蛋白表达降低都在30%以上。5. MEF2A干扰对各组小鼠血糖、体重、心脏重量和心体比的影响STZ注射21周后,小鼠血糖、体重、心脏重量和心体比被测量。和对照组相比,糖尿病组小鼠的体重和心脏重量都降低,但心体比值增加。和shRNA-MEF2A对照组比较,shRNA-MEF2A干扰组小鼠的心脏重量和心体比值降低,体重无明显变化。这些变化说明MEF2A干扰能够影响糖尿病诱导的心脏重构。6. MEF2A制减轻糖尿病诱导的心脏功能障碍超声心动图检测注射STZ21周后各种小鼠的心脏功能。和对照组比较,糖尿病组小鼠心脏功能参数LVEF、FS、E/A比E’／A’ 比值等降低,E/E’升高；和干扰对照组比较,MEF2A干扰组改善糖尿病诱导的上述心脏功能参数的变化。同时,和对照组相比,糖尿病组小鼠LVPWd增加,而MEF2A干扰减少糖尿病诱导的LVPWd增加。在糖尿病小鼠组中LVEDD也稍有升高,但和对照组比较无明显统计学意义。7. MEF2A抑制降低糖尿病导致的心脏纤维化Masson和天狼猩红染色显示糖尿病组小鼠心肌组织中血管周围和间质中细胞外基质沉积增加。定量分析显示,糖尿病组小鼠较对照组的间质和血管周围的细胞基质沉积分别增加2.6和2.05倍,而MEF2A干扰使其高糖诱导的沉积降低。8.MEF2A抑制减少糖尿病导致的胶原沉积免疫组化和Western blot分析结果显示：和对照组比较,糖尿病组小鼠的胶原Ⅰ和胶原Ⅲ沉积增加,而MEF2A干扰使高糖诱导的胶原沉积减少。9.在小鼠心肌中,MEF2A部分通过抑制EndMT抑制心肌纤维化免疫荧光双标检测心脏组织切片中CD31+/S100A4+和CD31+/α-SMA+细胞数,并用Z-stack分析图片,发现内皮和间充质标记物双阳性细胞个数在糖尿病小鼠心肌中增加,而心肌中注射MEF2A干扰病毒使糖尿病诱导的双阳性细胞数减少。同时,本实验用CD146阳性磁珠分选出心脏内皮细胞,并用RT-PCR检测其内皮和间充质标记物mRNA表达变化,发现其变化趋势和心脏切片的免疫荧光结果相一致：和对照组比较,糖尿病组小鼠心脏中提取的内皮细胞内皮标记物mRNA表达降低,间充质标记物mRNA表达升高,而糖尿病小鼠心肌内注射MEF2A干扰慢病毒使糖尿病所致的这种标记物的变化减轻。研究结论1.高糖使HUVECs的MEF2A表达升高,并使其发生由细胞核向细胞浆转位。2.MEF2A抑制可减轻高糖诱导的HUVECs的EndMT。3. MEF2A干扰抑制EndMT发生可能是通过其发生转位及与p38MAPK和Smads相互作用的调节。4.糖尿病小鼠心肌组织MEF2A干扰可改善心脏重构、功能障碍和心肌纤维化。5. MEF2A抑制改善心脏参数通过部分调节心肌组织EndMT的发生。