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基于哺乳动物受精机制和体细胞克隆技术的基本原理,为了更好地开发利用优良种公畜资源,本研究将牛的两个精子(代替体细胞)移植到去核的卵母细胞中,进一步促进其活化和胚胎发育,此技术被称为孤雄生殖技术。这种方法获得的牛精子克隆胚胎,可以克服传统核移植中供体细胞只能是体细胞的单一模式,创新地利用了两个精子取代体细胞作为供体注入去核牛卵母细胞胞质内生产牛克隆胚胎的一种新方法。为了全面系统地优化这种方法,本文主要从以下6个方面进行了研究,包括牛卵母细胞体外成熟培养液的优化、精子注射操作液的比较、去核方法比较、重构胚的激活方法和优化及重构胚胎的培养液优化等。现将结果简述如下:
试验1.为了提高牛卵母细胞的成熟率,在牛卵母细胞成熟培养液(IVM)中,分别添加5种浓度的胎犊血清(FCS)和牛卵泡液(BFF)组合,结果发现,添加10％FCS和20％BFF组的卵母细胞成熟率(65.8％)显著高于不添加FCS和BFF组(42.4％,P<0.05),在成熟培养中分别只添加10％的FCS、20％的BFF以及10％FCS和10％BFF对牛卵母细胞的成熟差异不显著(P>0.05),分别为52.5％、53.4％和58.6％,说明在在IVM中添加10％FCS+20％BFF有助于提高牛卵母细胞的成熟率。
试验2.由于卵母细胞的显微去核和双精子的显微注入都在操作微滴里完成,所以微滴的环境状态对卵母细胞和精子的有效存活起着十分重要的作用。为了减少显微操作过程对精子克隆胚胎的损伤,比较了两种注精子操作液对精子克隆胚的影响,研究结果发现,操作液Ⅱ和操作液Ⅰ对精子克隆胚胎发育的卵裂率分别为22.5％和17.5％,两者差异显著(P<0.05),囊胚发育率分别是6.0％和3.0％,两者差异不显著(P>0.05)。
试验3.为了比较盲吸去核法和染色定位去核法的去核效果及其对精子克隆胚发育的影响,将具有第一极体的成熟卵母细胞分别置入去核微滴中盲吸去核和含有5μg/mL Hoechst33342的去核微滴中染色定位去核,统计结果表明,盲吸去核组和染色定位去核组对精子克隆胚卵裂率有显著影响(分别为15.6％和20.3％;P<0.05),但对囊胚形成率没有差异显著(6.8％和7.4％;P>0.05)。因此,为了操作方便和提高去核效果,以染色定位去核法较好。
试验4.为了比较4种化学激活方法对精子克隆胚发育的影响,将克隆胚分成4组,分别用如下4种方法进行激活处理:组Ⅰ,用Ionomycin处理5min后用6-DMAP处理4h;组Ⅱ用Ionomycin处理5min后用CHX组处理5h;组Ⅲ用7％乙醇处理5min后用6-DMAP处理4h;组Ⅳ用7％乙醇处理5min后用CHX处理5h。结果发现,精子克隆胚培养2d后,组Ⅰ的卵裂率(20.5％)比组Ⅱ(12.1％)、组Ⅲ(7.6％)和组Ⅳ(7.0％)均高(P<0.05),但组Ⅱ、组Ⅲ和组Ⅳ之间差异不显著(P<0.05)。培养7d后,组Ⅰ激活的囊胚发育率(11.1％)显著高于其他组(P<0.05),其他各组(分别为6.05％、2.5％和4.8％)之间差异不显著,此研究结果表明Ionomycin+6-DMAP更有利于精子克隆胚的激活发育。
试验5.为了比较Ionomycin激活的时间长短对精子克隆胚发育的影响,将克隆胚分成2组,分别用如下2种方法进行激活处理:组Ⅰ,用Ionomycin处理5min后用6-DMAP处理4h;组Ⅱ,用Ionomycin处理10min后用6-DMAP处理4h。结果表明,组Ⅱ(激活时间为10min)的卵裂率(20.3％)和囊胚形成率(7.4％)均显著高于激活时间5min的卵裂率(4.26％,P<0.05)和囊胚形成率(4.26％,P<0.05)。说明Ionomycin激活精子克隆胚的时间对其发育有影响。
试验6.为了探讨培养液种类对牛精子克隆胚的影响,将牛精子克隆胚分成2组,分别用CR1aa和mSOF培养液培养。结果发现,CR1aa组的卵裂率为23.0％,显著高于mSOF组(17.8％,P<0.05),但囊胚的形成率(分别为7.40％和8.10％)没有显著性差异(P>0.05)。
试验1.为了提高牛卵母细胞的成熟率,在牛卵母细胞成熟培养液(IVM)中,分别添加5种浓度的胎犊血清(FCS)和牛卵泡液(BFF)组合,结果发现,添加10％FCS和20％BFF组的卵母细胞成熟率(65.8％)显著高于不添加FCS和BFF组(42.4％,P<0.05),在成熟培养中分别只添加10％的FCS、20％的BFF以及10％FCS和10％BFF对牛卵母细胞的成熟差异不显著(P>0.05),分别为52.5％、53.4％和58.6％,说明在在IVM中添加10％FCS+20％BFF有助于提高牛卵母细胞的成熟率。
试验2.由于卵母细胞的显微去核和双精子的显微注入都在操作微滴里完成,所以微滴的环境状态对卵母细胞和精子的有效存活起着十分重要的作用。为了减少显微操作过程对精子克隆胚胎的损伤,比较了两种注精子操作液对精子克隆胚的影响,研究结果发现,操作液Ⅱ和操作液Ⅰ对精子克隆胚胎发育的卵裂率分别为22.5％和17.5％,两者差异显著(P<0.05),囊胚发育率分别是6.0％和3.0％,两者差异不显著(P>0.05)。
试验3.为了比较盲吸去核法和染色定位去核法的去核效果及其对精子克隆胚发育的影响,将具有第一极体的成熟卵母细胞分别置入去核微滴中盲吸去核和含有5μg/mL Hoechst33342的去核微滴中染色定位去核,统计结果表明,盲吸去核组和染色定位去核组对精子克隆胚卵裂率有显著影响(分别为15.6％和20.3％;P<0.05),但对囊胚形成率没有差异显著(6.8％和7.4％;P>0.05)。因此,为了操作方便和提高去核效果,以染色定位去核法较好。
试验4.为了比较4种化学激活方法对精子克隆胚发育的影响,将克隆胚分成4组,分别用如下4种方法进行激活处理:组Ⅰ,用Ionomycin处理5min后用6-DMAP处理4h;组Ⅱ用Ionomycin处理5min后用CHX组处理5h;组Ⅲ用7％乙醇处理5min后用6-DMAP处理4h;组Ⅳ用7％乙醇处理5min后用CHX处理5h。结果发现,精子克隆胚培养2d后,组Ⅰ的卵裂率(20.5％)比组Ⅱ(12.1％)、组Ⅲ(7.6％)和组Ⅳ(7.0％)均高(P<0.05),但组Ⅱ、组Ⅲ和组Ⅳ之间差异不显著(P<0.05)。培养7d后,组Ⅰ激活的囊胚发育率(11.1％)显著高于其他组(P<0.05),其他各组(分别为6.05％、2.5％和4.8％)之间差异不显著,此研究结果表明Ionomycin+6-DMAP更有利于精子克隆胚的激活发育。
试验5.为了比较Ionomycin激活的时间长短对精子克隆胚发育的影响,将克隆胚分成2组,分别用如下2种方法进行激活处理:组Ⅰ,用Ionomycin处理5min后用6-DMAP处理4h;组Ⅱ,用Ionomycin处理10min后用6-DMAP处理4h。结果表明,组Ⅱ(激活时间为10min)的卵裂率(20.3％)和囊胚形成率(7.4％)均显著高于激活时间5min的卵裂率(4.26％,P<0.05)和囊胚形成率(4.26％,P<0.05)。说明Ionomycin激活精子克隆胚的时间对其发育有影响。
试验6.为了探讨培养液种类对牛精子克隆胚的影响,将牛精子克隆胚分成2组,分别用CR1aa和mSOF培养液培养。结果发现,CR1aa组的卵裂率为23.0％,显著高于mSOF组(17.8％,P<0.05),但囊胚的形成率(分别为7.40％和8.10％)没有显著性差异(P>0.05)。