研究背景:关节软骨损伤是一种常见的临床疾病。随着运动损伤不断增多,关节软骨损伤发病率呈上升趋势。膝关节疼痛是关节软骨损伤的主要临床表现,部分患者会出现关节交锁、功能障碍等,最终导致骨性关节炎。依据软骨损伤深度,可将关节软骨损伤分为三种:表层软骨损伤、全层软骨损伤和骨软骨损伤。表层软骨损伤,是指损伤发生在关节软骨表层,未累及潮线。全层软骨损伤累积潮线以下,但未穿透软骨下骨板。骨软骨损伤穿透软骨下骨板。一般表层软骨损伤不会自行修复,而全层软骨损伤会有纤维软骨愈合,弹性和硬度不及透明软骨。目前临床常用的治疗方法包括关节腔清洗术、微骨折术、自体骨软骨移植术(例如马赛克移植)、异体骨软骨移植术等,虽然可以缓解症状,但是软骨修复效果并不理想,存在很多的局限性。因此,研究一种促进软骨损伤修复的方法具有重要的临床意义。组织工程学是利用工程学和生命科学技术,研发能够修复或替代损伤组织的一门学科。基本原理是将高浓度的种子细胞接种在生物材料上,进行体外培养,材料为细胞提供临时的三维生长空间,有利于细胞的生长,然后将细胞/材料复合物植入到软骨损伤部位,用于修复或替换损伤的组织。在此过程中,支架材料的应用必不可少。组织工程支架需要满足以下要求:1)需要具备良好的组织相容性,有利于细胞粘附和生长;2)能够在体内降解,降解产物能够被吸收,不引起炎症反应和免疫反应;3)具备多孔结构,有利于细胞生长和营养物质交换;4)具备一定的理化性质,能够维持治疗初期的强度和韧性。聚癸二酸丙三醇甘油酯(Poly(glycerol sebacate),PGS)是一种人工合成的高分子聚合弹性体材料,具有良好的生物降解能力和组织相容性,但是存在降解速度过快和力学强度低的缺陷。聚已内酯(Polycaprolactone,PCL)是一种半结晶的生物可降解高分子材料,降解速率较慢,具有一定的力学强度和韧性,刚好可以弥补PGS的缺陷。本研究将PGS和PCL混合后通过共聚反应得到PGS-PCL复合材料,通过改变两种材料的摩尔比,调整材料的刚性、韧性、降解周期,并尽可能保证材料良好的组织相容性。应用选定的PGS-PCL材料制备软骨组织工程支架,用于软骨损伤修复的实验研究,具体实验方法如下。第一部分PGS-PCL聚合材料的制备及性能检测目的:1.从新西兰兔体内提取原代骨髓间充质干细胞(BMSCs)和关节软骨细胞(ACCs)。2.PGS与PCL按一定摩尔比混合共聚,构建PGS-PCL复合材料,评估材料的安全性和实用性,寻找最适合软骨组织工程的PGS-PCL材料。方法:抽取1月龄新西兰兔股骨及胫骨内骨髓血,分离培养骨髓间充质干细胞,通过成脂、成骨和成软骨多项诱导证明其多项分化能力。刀片刮取新西兰兔股骨和胫骨端关节软骨,提取原代软骨细胞,培养传代后鉴定。以癸二酸和丙三醇为原料,制备PGS。将PGS和购置的PCL分别以2:1、1:1、1:2摩尔比混合,通过共聚反应获得三组PGS-PCL复合材料,依次记为M1、M2、M3.万能力学分析仪检测三组材料的机械性能;体外降解实验分析材料的降解性能和稳定性;制备带有M1、M2、M3涂层的培养板,将BMSCs和ACCs分别接种在带有材料涂层的培养板内,进行单层体外培养,分析材料的细胞相容性。结果:1.新西兰兔骨髓血中提取的BMSCs能够向成骨、成软骨、成脂三系分化,具备干细胞特性;从新西兰兔膝关节软骨提取ACCs,阿利新蓝染色阳性。2.三组PGS-PCL复合材料(M1、M2、M3)均可在PBS缓冲液中缓慢降解,降解周期较PGS明显延长,降解过程中材料能够维持外形完整,以表面侵蚀的方式降解,未出现碎裂和塌陷,60天累计损失质量依次为23.63%,14.67%,13.01%。3.PGS和PCL的机械性能得到互补,随着复合材料中PCL比例增加,压缩模量、拉伸模量、抗拉强度增加,断裂延长率降低。能够满足软骨组织工程对力学性能的要求。4.三组PGS-PCL复合材料分别与BMSCs和ACCs体外共培养,观察细胞形态发现BMSCs和ACCs均能够维持典型的梭形和类圆形形态,细胞在M2材料有较好的增殖能力和细胞活性。结论:PGS-PCL复合材料具备良好的机械力学性能,生物降解能力和细胞相容性。通过改变底物PGS和PCL的摩尔比例,可以调节复合材料的力学强度和降解周期。PGS和PCL按1:1摩尔比混合,制备的PGS-PCL材料综合性能较好,具有制作软骨组织工程支架的潜能。第二部分PGS-PCL复合支架的体外评估目的:制备三种不同孔径的PGS-PCL复合支架,分析支架的机械特性、降解能力、细胞相容性,评估PGS-PCL复合支架在软骨组织工程领域应用的可行性,并筛选适合孔径结构。方法:将PGS和PCL按照1:1摩尔比混合,通过盐析法制备三组PGS-PCL复合支架,孔径分别为0-50μm、50-150μm、150-250μm,依次记为S1、S2、S3。扫描电镜观察支架结构,计算孔隙率,并对支架进行力学分析和降解性能检测。骨髓间充质干细胞以1×106/ml密度接种在PGS-PCL多孔支架上,进行体外3D培养。扫描电镜观察细胞在3D支架材料内的生长情况。CCK-8法检测细胞增长速率,Live/Dead检测细胞活力,F-actin染色观察细胞形态变化。结果:扫描电镜观察各组PGS-PCL复合支架(S1、S2、S3)具备三维多孔形态,孔径依次为0-50μm、50-150μm、150-250μm,平均孔隙率高于75%,孔隙间连通性好,便于营养物质转运和代谢产物排出。体外降解试验结果显示三组PGS-PCL复合支架在PBS溶液中缓慢降解,降解过程中材料能够维持支架多孔结构完整,以表面侵蚀的方式降解,未出现碎裂和塌陷,60天累计损失质量依次为25.37%,15.87%,13.05%。力学试验证实,PGS-PCL材料加工成多孔结构后,力学强度降低,韧性增高。体外细胞实验发现,不同孔径的三组PGS-PCL支架均表现出良好的细胞相容性,孔径为50-150μm的PGS-PCL支架细胞粘附性较好,增殖速度较快。结论:盐析法制备的PGS-PCL多孔支架,具有良好的机械力学性能和生物降解能力,细胞相容性好,当支架孔径在50-150μm范围内,更有利于BMSCs增殖和迁移。第三部分PGS-PCL复合支架搭载BMSCs的体外诱导及体内软骨再生的实验研究目的:1.对PGS-PCL软骨组织工程支架内的BMSCs进行成软骨诱导,体外测试支架的成软骨能力;2.PGS-PCL多孔支架搭载BMSCs修复新西兰兔膝关节软骨缺损体内实验,检测PGS-PCL支架的成软骨能力。方法:将BMSCs种植在PGS-PCL支架上,体外共培养1d,获得搭载一定数量BMSCs的PGS-PCL细胞支架。更换成软骨诱导培养基,在3D条件下诱导BMSCs向软骨方向分化,28天后提取标本,一部分标本包埋后,制作组织切片,另一部分作基因蛋白水平检测。选取3月龄新西兰兔,麻醉成功后在兔膝关节髌股关节面做一个直径3mm全层软骨缺损,将诱导后的BMSCs/PGS-PCL细胞支架植入到缺损区域,以未搭载细胞的PGS-PCL支架和单纯缺损模型作为对照组,术后12W和24w提取新生软骨组织标本,一部分用作力学分析和另一部分进行组织染色。结果:1.BMSCs/PCL-PCL细胞支架体外诱导后,细胞甲苯胺蓝染色和番红O染色阳性,细胞内GAG含量增高,成软骨相关基因(ACAN、COL2)表达明显升高2.体内实验结果显示,BMSCs/PGS-PCL支架修复组术后12W,软骨缺损部位出现新生“类软骨组织”,缺损部分填充,切片HE染色见新生软骨和周围软骨界限明显,仍有少量聚合材料残留,甲苯胺蓝染色和番红O染色弱阳性,COL2染色阳性。术后24W,缺损部位修复,切片染色提示为透明软骨修复,效果明显优于单纯支架组和空白对照组。结论:1.对PGS-PCL支架内的BMSCs进行体外成软骨诱导,BMSCs成功向成软骨方向分化。2.PGS-PCL组织工程支架具备修复兔膝关节软骨缺损的能力,新生关节软骨为透明软骨。第四部分肝素化PGS-PCL支架缓释转化生长因子-β3用于软骨修复的初步研究目的:将肝素与PGS-PCL支架混合,制备肝素化PGS-PCL支架(Hep-PGS-PCL支架),然后在Hep-PGS-PCL支架上添加转化生长因子-β3(TGF-β3),研究TGF-β3在支架上的吸附和缓释能力,以及对骨髓间充质干细胞的影响。方法:以肝素为媒介,提升PGS-PCL支架与蛋白类物质的结合能力,制备HepPGS-PCL支架,并检测支架缓释肝素的能力。在Hep-PGS-PCL支架上负载TGF-β3,评估复合支架的载药能力和缓释能力。在Hep-PGS-PCL-TGF-β3多孔支架上负载BMSCs,进行体外三维培养,评估复合支架体外成软骨诱导能力。结果和结论:1.骨髓间充质干细胞能够在肝素化Hep-PGS/PCL支架内粘附生长。2.转化生长因子-β3能够在Hep-PGS/PCL支架上缓慢持续释放,在体外促进BMSCs向成软骨方向分化。3.针对Hep-PGS/PCL-TGF-β3缓释支架的研究尚处于初步阶段,需要进一步实验证实Hep-PGS/PCL-TGF-β3缓释支架的细胞相容性和体内成软骨能力。