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肝素和硫酸乙酰肝素(HS)是被广泛应用于临床中的抗凝血药物多糖,同时研究发现其可能在抗癌、抗病毒具有一定的作用。医药级别的肝素从家畜肠粘膜分离得到,然而从动物组织制备的肝素存在潜在的污染隐患。因此,微生物来源的heparosan合成肝素及其衍生物成为研究热点。本文以酶法合成肝素/HS为目的,对硫酸化修饰酶硫酸乙酰肝素2-O硫酸基转移酶Hs2st进行了克隆表达、纯化及其表达条件的优化。利用RT-PCR技术,以小鼠肝脏RNA为模板,成功克隆了Hs2st基因片段,并与pMD19-T载体连接,构建了pMD19T-Hs2st克隆载体。经过PCR验证、测序比对分析,克隆片段与目标条带100%相符,同时经BioEdit软件分析发现Hs2st基因片段编码356个氨基酸,Hs2st蛋白大小约为33 kDa。在成功克隆获得Hs2st的基础上,构建了表达质粒pMAL-c2X-Hs2st,并将其转化至E. coli TB1,获得了重组菌E. coli TB1/pMAL-c2X-Hs2st。经过IPTG的诱导,实现了融合蛋白MBP-Hs2st的成功表达,经过Amylose亲和层析得到了MBP-Hs2st蛋白,UN-Scan-it ge16.1软件分析融合蛋白分子量,大小约为75 kDa,Amylose亲和层析纯化收率可达47%。为确立Hs2st的高效生产工艺,利用麦芽糖结合蛋白(MBP)与Hs2st融合性能,通过构建相应的表达质粒,在大肠杆菌方面实现了Hs2st的可溶性表达。通过对LB培养基摇瓶培养大肠杆菌pMAL-c2X-Hs2st的最佳宿主菌、诱导时机、诱导剂用量、诱导时间以及添加葡萄糖和乙醇等一系列培养条件的优化,确定了该可溶性融合蛋白MBP-Hs2st的最佳生产条件,即(1)最佳宿主菌为Ecoli TB1。(2)最佳的诱导时机是菌体对数生长中后期(OD600约为0.6),最佳诱导剂IPTG终浓度为O.4 mmol/L。 (3)对目的蛋白MBP-Hs2st表达有最佳促进作用的葡萄糖初始质量浓度范围为0.5-1.5 g/L。(4)向LB培养基中添加少量的热休克物质乙醇可以提高MBP-Hs2st的表达,最佳浓度范围为1%-3%。