脑梗塞是由于局部脑供血障碍导致脑组织急性缺血、缺氧而发生的脑坏死、软化。血栓形成是造成脑梗塞的重要原因之一。课题组前期研究表明，天麻乙酸乙酯提取物对脑缺血损伤动物模型有显著的脑保护作用，且具有较强的抗血栓形成及抗血小板聚集作用，提示，天麻乙酸乙酯提取物可能通过对抗血栓形成而达到预防脑梗塞发生的目的。在随后的研究中发现，天麻脑保护作用的物质基础为天麻乙酸乙酯提取物中的一组酚性成分，其中，不同的成分可通过抗氧化损伤或保护血脑屏障而发挥脑保护作用，提示，天麻脑保护作用可能是其所含的多个化学成分作用于脑缺血损伤的不同环节的综合作用结果。为进一步探明这些成分的脑保护作用特点，结合前期研究的结果，本研究以天麻乙酸乙酯提取物中体外抗血小板聚集活性筛选得到的活性较强的酚性成分B、C、D为代表，从抗血栓形成角度对3个成分的作用及机制进行了研究。1.天麻酚性成分B、C、D抗血栓形成活性研究目的：明确天麻酚性成分B、C、D的抗血栓形成作用。方法：采用结扎大鼠下腔静脉导致下腔静脉血栓形成及经大鼠一侧颈内动脉注射血栓诱导剂诱发同侧大脑半球血栓形成的方法，考察天麻酚性成分B、C、D抗血栓形成作用。结果：天麻酚性成分B﹑C﹑D高﹑低剂量(20mg/kg﹑10mg/kg)均能显著对抗大鼠静脉血栓形成，减轻血栓湿重。3个成分高﹑中剂量(20mg/kg﹑15mg/kg)均能显著对抗大鼠实验性脑血栓形成。结论：天麻酚性成分B、C、D均能显著对抗大鼠下腔静脉血栓形成和脑血栓形成。2.天麻酚性成分B、C、D抗血栓作用机制研究目的：从抗血小板聚集的角度对天麻酚性成分B﹑C﹑D的抗血栓形成机制进行探讨。方法：(1)按Born氏比浊法，分别以ADP、AA、PAF为诱导剂，利用小板聚集仪测定5min内血小板最大聚集率。(2)采用Frua-2/AM荧光探针检测血小板细胞游离钙浓度[Ca2+]i的变化，探讨天麻酚性成分B、C、D是否具有抑制血小板细胞内钙释放及外钙内流的作用。(3)用环磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)酶联免疫试剂盒检测血小板cAMP的活性，计算cAMP的含量，评价成分B、C、D是否可影响血小板cAMP的水平。(4)用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测成分C、D对血小板P2Y12受体表达的影响，探讨成分C、D是否具有抑制血小板P2Y12受体表达的作用。结果：(1)天麻酚性成分对ADP、AA、PAF三种途径的血小板聚集具有选择性的对抗作用，通过体外筛选的方法显示，天麻酚性成分B对抗AA途径的血小板聚集作用最强，对ADP诱导的血小板聚集仅高浓度时有效；天麻酚性成分C、D对抗ADP途径的血小板聚集作用最强；对PAF诱导的血小板聚集作用3个成分在本研究浓度下对抗作用不明显。(2)天麻酚性成分B (0.4mg/mL、0.1mg/mL)对AA诱导的家兔血小板细胞外钙内流与内钙释放均具有显著地抑制作用(P<0.01)；天麻酚性成分C (0.4、0.1mg/mL)对ADP诱导的家兔血小板细胞外钙内流与内钙释放均具有显著地抑制作用(P<0.01)；天麻酚性成分D在本浓度下对ADP诱导的家兔血小板细胞外钙内流及内钙释放抑制作用不明显(P>0.05)。(3)天麻酚性成分B(0.4mg/mL、0.1mg/mL)、成分C(0.4mg/mL、0.1mg/mL)、成分D(0.4mg/mL、0.1mg/mL)均能不同程度提高富血小板血浆cAMP水平(P<0.01；P<0.05)。(4)天麻酚性成分C(20mg/kg、10mg/kg)、成分D(20mg/kg、10mg/kg)均能显著地抑制血小板P2Y12受体的表达(P<0.05)；天麻酚性成分B在本研究浓度下对P2Y12受体表达的抑制作用不明显。结论：(1)天麻酚性成分B可显著抑制实验性血栓形成，其作用主要是通过抑制AA诱导的血小板内钙释放和外钙内流、提高血小板cAMP水平而对抗血小板聚集，防止血栓形成。(2)天麻酚性成分C可显著抑制实验性血栓形成，其作用主要是通过抑制ADP诱导的血小板内钙释放和外钙内流、提高血小板cAMP水平及抑制血小板P2Y12受体表达而对抗血小板聚集，防止血栓形成。(3)天麻酚性成分D可显著抑制实验性血栓形成，其作用主要是通过提高血小板cAMP水平及抑制血小板P2Y12受体表达而对抗血小板聚集，防止血栓形成。3.天麻酚性成分B、C、D急性毒性研究目的：对天麻酚性成分B、C、D小鼠经口给药的急性毒性进行了考察，以期了解3个成分的急性毒性情况。方法：天麻酚性成分B、C、D递减稀释，按不同级差，等溶积不同浓度经口给予小鼠，测3个成分小鼠经口给药的急性毒性，对其安全性进行初步评价。结果：天麻酚性成分B经口给药的小鼠半数致死量(lethal dose50, LD50)为3.45g/kg；天麻酚性成分C的LD50为1.34g/kg；天麻酚性成分D的LD50为1.23g/kg。