苏云金芽胞杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis var.israelensis,Bti)是用于防治蚊、蚋等病媒生物的重要生物因子,但实际应用中存在毒力水平不够高、持效期短等问题。Sigma K(σK)因子在芽胞杆菌中能够控制芽胞形成、母细胞裂解等,同时通过Sigma(σ)因子间的级联调控,影响杀虫蛋白的形成。本文通过构建缺失σK因子的Bti突变菌株,研究了 sigK缺失对Bti生产菌株Bt-59的影响,为构建高毒力活性、持效期长的工程菌提供参考。主要研究结果如下:(1)构建了 Bt-59的sigK缺失突变菌株Bt59(△sigK):通过对Bt-59菌株全基因组测序分析,确定sigK基因的位于Genomel 05261,大小为714bp,编码237个氨基酸,与已报道的其他Bt亚种相似性均为100%。通过扩增sigK基因同源臂构建敲除载体pMADAsigK,电击转化Bt-59感受态菌株,筛选获得同源重组缺失sigK突变株Bt59(△sigK);克隆包含sigK基因及其启动子区域的1495 bp的片段PsigK-sigK,利用pHT315表达载体连接PsigK-sigK,转化突变株Bt59(△sigK)中构建获得sigK的恢复菌株 Bt59(HFsigK)。(2)明确了sig 突变对Bt-59菌株芽胞形成的作用:Bt59(△sigK)的营养期生长与原菌株Bt-59无明显差异,但培养后期观察不到芽胞的形成;而sigK基因恢复菌株Bt59(HFsigK)恢复了芽胞的形成,其总细胞数和芽胞数分别为4.64×107 CFU/mL 和 3.33×106 CFU/mL,与原菌株 2.43×106 CFU/mL 芽胞量相当,说明 sigK基因的缺失导致Bt-59菌株失去形成芽胞的能力。sigK缺失同时影响到Bti母细胞的裂解,使母细胞完全裂解时间从T25延长到T60,而Bt59(HFsigK)则又使细胞裂解速度恢复到原菌株水平。(3)分析了sig 突变对Bt-59杀虫蛋白形成和杀虫活性的影响Bt59(△sigX)培养后期能正常形成杀虫晶体蛋白,晶体形态及其大小未发生明显变化。SDS-PAGE检测结果表明,sigK突变影响了 Bt-59菌株中不同杀虫蛋白的表达量,Bt59(△sigK)中Cry4Aa/4Ba蛋白表达量提高了约1.67倍,Cyt1Aa蛋白提高了约1.21倍,而Cry1 1Aa蛋白的表达量无明显差异。生测结果表明,Bt59(△sigK)对淡色库蚊(Culexpipienspallens)的杀虫活性略微降低,而对白纹伊蚊(Aedesalbopictus)的杀虫活性则无明显影响。(4)sigK突变对Bt-59水解酶CwlC的影响:克隆并原核表达了 Bt-59菌株732 bp的cwlC片段,细胞壁裂解试验表明CwlC具有水解细胞壁活性。通过扩增617 bp cwlC启动子区域(PBcwIC)连接pHT304-18Z得到重组载体pHTPBcwlC,电击转化Bt59(△sigK)菌株中构建了 BcwlC-lacZ表达菌株Bt59(△sigK)(PBcwlc-lacZ)。lacZ活性测定发现在Bt59(△sigK)中没有转录活性,表明Bt-59 cwlC基因受sigK基因的控制。通过比较Bt库斯塔克亚种HD73母细胞裂解基因,Bt-59 CwlC能够恢复HD(△cwlC)的表型,说明Bt-59 CwlC具有水解功能。