口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部最常见的恶性上皮肿瘤,主要发病机制是机体免疫功能异常致使肿瘤免疫逃逸,其中树突状细胞（DC）功能异常是OSCC免疫逃逸的主要机制。DC来源于骨髓中的造血干细胞,其分化可分为三个阶段为:前体DC（pre-DC）,未成熟DC及成熟DC。DC是体内最强大的专职抗原递呈细胞,能够激发或抑制抗原特异性的T细胞反应,即未成熟DC处于耐受状态,抑制T细胞反应,而成熟DC能够诱导naive T细胞活化发挥其免疫功能,但其免疫功能由所处的微环境决定。进一步,无论是在肿瘤细胞还是在肿瘤浸润的免疫细胞内信号转到及转录活化因子3（STAT3）异常活化,其活化可导致微环境改变促使DC功能异常,致使宿主难以产生有效的抗肿瘤免疫反应。血管内皮生长因子（VEGF）在多种肿瘤中高表达,其不仅能够促进血管生成并发挥免疫抑制的功能。本课题组前期研究发现:OSCC患者外周血及癌灶组织内VEGF高表达,外周血中DC数目降低,癌灶中未成熟DC数目增加,且外周血中VEGF浓度与DC呈负相关;体外实验显示OSCC肿瘤细胞培养上清可抑制DC成熟。基于以上研究,我们提出假设:VEGF可趋化前体DC至肿瘤癌灶组织通过JAK/STAT3诱导OSCC患者DC异常分化、功能异常致使免疫抑制发生。1、口腔鳞癌中前体DC异常分化为具有免疫抑制功能的髓样起源抑制细胞（MDSC）DC来源于骨髓造血干细胞,是终末分化的髓系细胞。在骨髓微环境内,造血干细胞分化为多潜能造血干细胞,在多种因子刺激下多潜能造血干细胞分化为髓样谱系祖细胞及淋巴样谱系祖细胞,髓样谱系祖细胞分化为巨噬/DC祖细胞,巨噬/DC祖细胞可分化为DC细胞及单核细胞,单核细胞在体内及体外可分化为DC及巨噬细胞。DC可来源于多种前体DC细胞。最近研究证明在人类中,单核细胞为主要的前体DC.DC为体内抗原递呈能力最强大的抗原递呈细胞,其连接了天然免疫反应及获得性免疫反应,DC的主要功能是感受危险信号摄取相关抗原后活化、成熟并激活naive T细胞使其增殖分化发挥其免疫功能,清除抗原。DC分化的三个阶段为:前体DC、未成熟DC、成熟DC。骨髓中前体DC为一群异质性细胞,前体DC及未成熟DC在多种因子的作用下离开骨髓进入外周循环,并进入外周组织发挥免疫监视起“哨兵”作用。居于组织中的DC为未成熟DC,他们可感受细菌、病毒及各种危险刺激信号后获取抗原并活化,上调趋化因子受体并迁移至淋巴组织,高表达共刺激分子及分泌大量细胞因子将抗原递呈给T细胞介导T细胞活化,发挥其免疫功能。正常生理条件下,DC参与了中枢及外周T细胞免疫耐受。大量数据证实免疫系统对于肿瘤的发生及发展意义重大。若天然或获得性免疫反应被削弱或被抑制,肿瘤发生几率大大增加。位于外周组织中的“哨兵”DC首先感知异常的信号对于免疫反应起始意义重大。大量研究证明荷瘤鼠及多种类型的肿瘤患者体内循环DC降低,且肿瘤部位未成熟DC大大增加,功能异常,不能有效递呈抗原激活T细胞。研究也证实肿瘤患者中异常的髓系细胞分化是DC异常的主要机制。这种异常分化会产生三种结果:功能性DC数目降低;未成熟髓样细胞增加;未成熟DC数目增加。然而在高免疫抑制的肿瘤微环境内,DC难以诱导有效的T细胞反应。由此推断,肿瘤微环境改变了髓样细胞的分化,使本应发挥免疫清除功能的细胞类型异常分化为具有免疫抑制功能细胞类型。其中,髓样起源抑制细胞（Myeloid derived suppressor cell,MDSC）来源于髓样细胞的具有免疫抑制功能的细胞,且其与DC共同来源于谱系相同的髓样细胞。研究证明,异常分化DC及DC功能缺陷是系统性的,在肿瘤发生中肿瘤分泌的多种因子影响了髓系细胞分化发育。肿瘤细胞分泌大量具有免疫抑制功能的因子造成了免疫抑制的肿瘤微环境。DC功能异常是肿瘤逃避免疫监视的主要机制。虽然前体DC是一群异质性的细胞,但其分化及功能受外源性因子的调控。肿瘤细胞分泌的多种可溶性因子组成了肿瘤免疫抑制的微环境,可影响骨髓及脾脏免疫细胞的分化。VEGF为肿瘤细胞及血管内皮细胞分泌的可溶性因子,其不但通过促进内皮细胞生成血管,且其具有免疫抑制功能。肿瘤释放的可溶性因子可使MDSC增加,增加的MDSC会促进血管形成及肿瘤转移。而在口腔鳞癌肿瘤患者中,髓样细胞的分化是否脱离了其正常分化发育途径,即并未分化发育为具有免疫功能的DC,而是发育分化为病理性的具有免疫抑制功能的MDSC?为了探索OSCC患者外周血中DC分化是否出现异常,本研究获取了 47例口腔鳞癌患者的外周血单个核细胞,利用流式细胞术检测了表达CD1c的髓样DC（mDC）、表达CD85g的浆细胞样（pDC）及CD33+CD14+HLA-DRlow/-的具有免疫抑制功能的髓样起源抑制细胞（MDSC）比例,并评价了患者的CD4+辅助性T细胞、CD8+胞毒性T细胞以及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）比例。研究发现,OSCC患者外周血PBMC中mDC及pDC比例较健康人显著降低（P<0.0001）而具有免疫抑制功能的MDSC 比例显著升高（P<0.0001）;具有免疫抑制功能的Treg细胞及抑制性CD8+T细胞比例显著升高（P<0.0001,P<0.05）,而CD4+辅助性T细胞显著性降低（P<0.005）。由此可以推断,口腔鳞癌患者的外周处于免疫抑制状态,且DC的比例及MDSC的比例异常表明DC分化出现异常。而我们前期的研究发现,口腔鳞癌患者外周血内VEGF显著升高,且与DC数目及比例呈负相关,体外实验也显示口腔鳞癌肿瘤细胞分泌的VEGF抑制了 DC成熟,但是关于VEGF是否参与了 DC分化的研究还未有报道。为了确定口腔鳞癌肿瘤微环境内VEGF是否参与了 DC的异常分化,我们将健康人外周血单核细胞与高表达VEGF及添加VEGF的单抗（Avastin Beva,Ava）的口腔鳞癌细胞系HSC-3共培养,发现高表达VEGF的口腔鳞癌细胞促进了 MDSC形成,用Avastin Beva拮抗VEGF表达后MDSC细胞比例降低。由此可以推断口腔鳞癌微环境内VEGF参与了前体DC分化,使其分户为具有免疫抑制功能的MDSC。OSCC患者外周血中髓样细胞的分化出现异常,具有免疫功能的DC数目降低,而与DC共起源于髓样祖细胞的MDSC细胞比例却大量增加,且机体内具有免疫抑制功能的Treg细胞以及抑制性CD8+T细胞也显著增加。我们推测:口腔鳞癌患者外周血内前体DC分化异常。但肿瘤组织局部DC数目及状态的如何?研究发现肿瘤组织内浸润有大量未成熟DC,且肿瘤癌巢内DC为未成熟的,而在间质组织内DC为相对成熟的。而肿瘤细胞分泌的VEGF会使癌灶内浓度显著高于间质内浓度,这些事实进一步证明肿瘤细胞分泌的因子影响了 DC的分化。口腔鳞癌癌灶组织分为癌巢及间质,癌巢由上皮性的肿瘤细胞组成,间质有成纤维细胞、免疫细胞等组成。那么在口腔鳞癌的癌灶内,前体DC在肿瘤不同部位浸润如何?高表达VEGF 口腔鳞癌细胞是否趋化了前体DC至癌灶,并参与肿瘤的进程。我们首先取37例OSCC患者的癌灶组织以及对应的癌旁组织,利用q-PCR技术在基因水平探明VEGF、CD14以及单核细胞趋化因子MCP-1的表达,并分析了三者的相关性。研究发现:OSCC癌灶组织内VEGF、CD14、MCP-1的表达显著高于对应的癌旁组织（P<0.05）,且VEGF的表达与MCP的表达呈正相关（P=0.00005）。在蛋白水平,我们获取了 79例OSCC患者的组织,利用免疫组化技术分析癌旁正常上皮、癌旁异常增生上皮及OSCC癌灶（间质及癌巢）不同区域内VEGF的表达、表达CD14的前体DC以及表达CD208的成熟DC的浸润状况。研究发现:OSCC患者癌旁异常增生组织内VEGF的表达及表达CD14和CD208细胞的浸润数目显著低于癌灶组织（P<0.0001）,且异常增生组织内VEGF、CD14和CD208的表达显著高于癌旁正常上皮组织（P<0.0001）;进一步我们对口腔鳞癌癌灶及间质组织内VEGF表达、CD14+前体DC及CD208+成熟DC浸润与临床病理参数进行相关性分析,我们发现口腔鳞癌癌灶组织癌巢内VEGF表达与肿瘤的TNM分期呈正相关（P=0.017）;间质内而非癌灶内CD14-前体DC浸润与肿瘤分化呈正相关（P=0.0478）;CD208-成熟DC细胞浸润与淋巴结转移呈正相关（P=0.036）。研究发现OSCC患者癌灶组织内VEGF、MCP-1及CD14表达显著高于对应的癌旁组织,且VEGF表达与MCP-1表达呈正相关。这些结果提示,口腔鳞癌中VEGF能够趋化前体DC至肿瘤区,并参与了肿瘤进程。2、口腔鳞癌中VEGF趋化前体DC至肿瘤区参与肿瘤进程研究发现多种肿瘤组织内有大量未成熟DC浸润,推测肿瘤细胞分泌的可溶性因子促进了前体DC迁移至肿瘤发生部位。在人体中,单核细胞为DC的主要来源。在炎症信号及各种信号刺激下,单核细胞离开血液迁移到外周组织,依据外周组织微环境内的细胞因子等刺激分化发育为DC、巨噬细胞或其他类型的细胞发挥其免疫功能。人类的单核细胞分为CD14+及CD16+细胞。单核细胞被动员并趋化到什么部位对于其功能发挥具有重大作用,募集单核细胞至炎症部位对有效清除病原意义重大,但是募集的单核细胞对于病理性的炎症相关疾病包括OSCC也具有重要作用。目前研究已证实慢性炎症是肿瘤的特征,尤其对于胃癌、直肠癌及口腔鳞癌,慢性炎症时肿瘤的特征。在多种炎症环境下,单核细胞具有分化的多潜能性,可分化为DC,巨噬细胞,神经胶质细胞及其他类型的细胞。单核细胞可被募集到肿瘤部位,发挥抑制肿瘤特异性免疫反应的作用。肿瘤细胞分泌VEGF造成肿瘤区域内VEGF高表达,而肿瘤部位高浓度的VEGF可影响间质细胞并可随循环系统进入外周血,因此肿瘤患者外周血中VEGF较健康人高,但较癌灶组织低。为了探明癌灶组织内高浓度的VEGF是否趋化外周血内前体DC至肿瘤区,我们获取了小鼠骨髓细胞,我们用低浓度的VEGF预处理前体DC以模拟荷瘤者外周血中前体DC,再用含高浓度VEGF的口腔鳞癌细胞株培养上清模拟肿瘤微环境进行Transwell实验,观察高浓度的肿瘤微环境对前体DC趋化的影响并观察其分化。研究发现OSCC微环境内高浓度的VEGF可趋化前体DC至肿瘤微环境内;在DC分化早期即第2及4天,OSCC微环境对低浓度VEGF预处理的前体DC趋化能力强,而在DC分化后期即第6及8天对未处理的前体DC趋化能力强。由此我们得出证实:VEGF促进了前体DC迁移至口腔鳞癌微环境内。为了验证VEGF抑制了 pre-DC分化,我们将获取的骨髓细胞添加VEGF培养,在第2,4及第6天,检测其表面标记CD1c,CD40,CD80,CD86及MHC-Ⅱ的表达,发现减价VEGF后DC表面的标记显著性降低。在第6天对DC的吞噬能力检测发现VEGF促进了 DC的吞噬。由以上结果我们证明口腔鳞癌内VEGF促进了前体DC迁移至口腔鳞癌微环境内且抑制了其正常分化。3、口腔鳞癌中VEGF可通过JAK/STAT3通路调控前体DC分化DC功能异常是系统性的（包括在外周血及肿瘤组织）,其异常源于肿瘤分泌的可溶性因子。肿瘤分泌的可溶性细胞因子及趋化因子控制了DC的募集、浸润及分化。肿瘤微环境内存在高浓度的免疫抑制因子例如VEGF、IL-10等,免疫抑制因子可激活肿瘤中（包括肿瘤细胞及浸润的免疫细胞）STAT3,活化的STAT3促进了免疫抑制因子的产生,且改变免疫细胞的基因表达程序,抑制抗肿瘤免疫反应的发生。STAT3活化也可促进肿瘤细胞增殖、促进肿瘤血管生成、加速肿瘤转移及免疫抑制,研究证实STAT3在肿瘤细胞及免疫细胞内过度活化,连接了炎症与肿瘤。STAT3活化可通过抑制多种促炎因子及趋化因子抑制DC活化。体外实验证实肿瘤中抑制DC祖细胞STAT3活化减少了未成熟DC数目,而成熟DC数目会增加。将骨髓造血干细胞内STAT3失活后,肿瘤内在的免疫监视机制启动,抗肿瘤免疫反应增强,能够抑制肿瘤生长、进展及转移,且荷瘤鼠体内DC、T细胞及NK细胞免疫功能增强。由此可以推测:抑制肿瘤患者前体DC内STAT3活化可使DC分化途径正常使其功能恢复。STAT3信号对于DC分化及成熟具有重要作用。肿瘤微环境内募集了大量具有免疫抑制的髓样细胞,形成了重要的免疫抑制细胞,其中这些髓样细胞内STAT3处于活化状态。口腔鳞癌中VEGF通过何种机制抑制前体DC分化?已知STAT3在多种肿瘤的肿瘤细胞及浸润的免疫细胞内活化,但STAT3是否参与了前体DC异常分化及机制却不清。为了探明OSCC内VEGF是否通过JAK/STAT3通路改变了 DC的正常分化途径。首先,我们获取了 37例OSCC患者癌灶组织以及对应的癌旁组织,在基因水平分析VEGF、MCP-1以及STAT3表达,并分析三者之间的相关性。研究发现:VEGF与MCP1表达呈正相关（P<0.001）,VEGF表达与STAT3表达呈正相关（P<0.001）,MCP-1与STAT3表达呈正相关（P<0.001）。在蛋白水平,我们获取79例口腔鳞癌患者肿瘤组织,利用免疫组化技术分析癌旁正常上皮、癌旁异常增生上皮及OSCC癌灶（间质及癌巢）内STAT3以及p-STAT3的表达。研究发现OSCC癌患者癌旁异常增生组织内STAT3及p-STAT3表达显著低于癌灶组织（P<0.001）,但显著高于癌旁正常上皮组织（P<0.001）;我们分析了 STAT3及p-STAT3表达与临床病理参数的相关性,研究发现:OSCC癌灶组织内,无论是癌巢还是间质组织内STAT3表达与患者的年龄、性别、吸烟状况、病理学分级（分化）、TNM临床分期、炎性细胞浸润以及是否存在淋巴结转移都无相关性（P>0.05）。我们首次发现OSCC癌巢组织内p-STAT3表达与肿瘤分化相关（P=0.05）,且间质内p-STAT3表达与炎性免疫细胞浸润相关（P=0.025）,而与其他的临床病理参数无相关性（P>0.05）。进一步,我们分析了 OSCC癌灶组织的癌巢内、间质内以及OSCC癌旁异常增生组织内VEGF表达与癌巢、间质以及异常增生组织内p-STAT3表达之间的相关性,研究发现,癌灶癌巢组织内的VEGF表达与癌巢及间质内p-STAT3的表达有显著相关性（P=0.02,P=0.03）。但OSCC肿瘤组织内CD14+的pre-DC内STAT3是否表达,且是否活化?我们获取OSCC新鲜组织,经冰冻切片后进行激光共聚焦实验,我们发现:肿瘤组织内VEGF高表达,且CD14+细胞内STAT3以及p-STAT3表达。由此我们推测,OSCC肿瘤细胞分泌的VEGF促进了 OSCC肿瘤细胞STAT3的活化,且使间质内前体DC内STAT3异常活化,进而使前体DC分化异常,造成了 OSCC肿瘤免疫抑制的发生。为了验证OSCC鳞癌微环境内VEGF是否是通过JAK/STAT3通路使前体DC分化异常,我们获取小鼠骨髓细胞,用重组的VEGF蛋白、小鼠肿瘤细胞系SCC-7培养上清（TS）、添加Avastin Beva的SCC-7培养上清与前体DC共同培养,在第七天收集细胞进行Western blot实验。研究发现添加VEGF蛋白以及OSCC培养体系中p-STAT3表达较对照组显著升高,而在添加Avastin Beva的SCC-7组内p-STAT3表达较单纯的SCC-7组内低,由此我们可以证实OSCC内VEGF可通过JAK/STAT3通路调控前体DC异常分化。综上所述,本研究①首次发现高表达VEGF的OSCC肿瘤中前体DC异常分化为具有免疫抑制功能的MDSC而非具有免疫功能的DC;②首次发现癌灶中VEGF、CD14及p-STAT3表达与肿瘤进程有关;③在口腔鳞癌中发现OSCC肿瘤细胞分泌的VEGF也可趋化前体DC至癌灶并确认可通过JAK/STAT3通路异常活化调控DC异常分化;④首次发现OSCC患者癌巢内间质内STAT3活化与肿瘤浸润的免疫细胞的关系。