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背景和目的胆管癌是指发生于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,近年来发病率有上升趋势。即使采用以手术治疗为主并辅以放、化疗等综合方案,总体预后较差,因此探索针对胆管癌的抗肿瘤药物,以加强手术及放化疗效果,为改善患者预后提供新的思路。丙酮酸脱氢酶激酶（Pyruvate dehydrogenase kinase,PDHK）是线粒体丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate dehydrogenase Complex,PDC）的负调节因子,在有氧糖酵解代谢中起着十分重要的调控作用。现已鉴定出PDHK有四种同工酶:PDHK1、PDHK2、PDHK3以及PDHK4。越来越多证据显示肿瘤组织及细胞中PDHK表达或活性异常与肿瘤的恶性表型具有一定的相关性,且与缺氧诱导的药物耐药相关,因此,PDHK可能是一个潜在的新的提高化疗疗效和克服药物耐药的靶点。二氯乙酸钠（Dichloroacetic,DCA）是一种小分子丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂,通过靶向PDHK能增加肿瘤细胞对化疗的敏感性进而在某种程度上克服药物耐药;然而DCA具有肝脏和外周神经毒性作用,因此,寻求活性高且毒副作用较弱的PDHK抑制剂对抗癌治疗具有重要意义。二氯乙酸二异丙胺（Diisopropylamine Dichloroacetate,DADA）为维生素B15的活性成份,是DCA类似物,既往研究显示DADA在体内外可抑制多种恶性肿瘤细胞株的增殖,诱发凋亡,且DADA的作用明显强于DCA。同时有证据显示DADA不仅可抑制食管癌细胞生长,而且可能是通过调节氧化磷酸化增加细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平,进而提高肿瘤细胞对放射的敏感性。迄今为止关于PDHK1-4在胆管癌中的表达情况及DADA是否具有抗胆管癌的效果还不清楚。因此,本研究通过对临床组织样本的检测及体外实验,探讨PDHK1-4在胆管癌细胞中的表达情况、DADA对胆管癌细胞增殖、凋亡和能量代谢的影响,并观察低浓度的DADA是否增强胆管癌对化疗敏感性,并在动物模型中进行验证,为下一步人体临床试验提供依据。本课题研究结果有望为胆管癌提供一个有效并适合临床转化的治疗策略。方法1.采用免疫组化方法检测PDHK1、PDHK2、PDHK3及PDHK4在胆管癌组织和癌旁组织中的表达情况,并分析PDHK1-4与患者临床病理特征的关系,并采用Kaplan-Meier法绘制胆管癌患者的生存曲线,根据PDHK1-4表达水平高低,以log-rank进行组间比较,确定PDHK1-4表达水平和胆管癌患者预后的关系。2.选用胆管癌细胞RBE和QBC939细胞系作为研究对象,采用不同浓度DADA处理胆管癌细胞后,通过CCK-8实验检测胆管癌细胞RBE和QBC939增殖能力的变化;采用Annexin V-FITC-PI凋亡检测试剂盒检测凋亡,Western Blotting检测凋亡相关标记物Caspase9、PARP、bcl-2及bax的表达;采用流式细胞仪观察DADA对胆管癌细胞周期的影响,Western Blotting检测周期相关蛋白CyclinD1及Cdc2的表达;采用不同相关试剂盒检测DADA作用前后胆管癌细胞的葡萄糖摄取能力、乳酸生成能力、ATP含量、PDH活性以及细胞内ROS水平,Western Blotting检测糖酵解相关蛋白 PDHK1、PDHK2、PDHK3、PDHK4、PDH 及磷酸化 PDH（pPDH Ser293）的变化情况;使用ROS清除剂观察DADA对细胞凋亡的影响是否通过ROS信号通路所介导。3.采用CCK-8试验检测DADA、顺铂单独及联合应用对胆管癌RBE、QBC939细胞增殖活力的影响,通过CompuSyn软件计算DADA与顺铂的协同指数（cooperativity index,CI）。同时在Balb/c裸鼠上进行QBC939移植成瘤实验,分别给予DADA、顺铂、联合DADA+顺铂处理,观察不同治疗组对裸鼠移植瘤的生长的影响。结果1.胆管癌组中PDHK1、PDHK2、PDHK3以及PDHK4表达水平显著高于其相对应的癌旁组织（P<0.05）。单因素分析显示PDHK1的表达水平与患者年龄、性别、术前血清CA199、AFP、CEA、肿瘤部位、肿瘤大小、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结转移及TNM分期等特征无关（P>0.05）;PDHK2的高表达和肿瘤部位、脉管侵犯及TNM分期相关（P<0.05）,而与年龄、性别、术前血清CA199、AFP、CEA、肿瘤大小、神经侵犯及淋巴结转移等特征无关（>0.05）;PDHK3的异常表达与胆管癌分化程度及TNM分期相关（P<0.05）;PDHK4的异常表达仅和术前CEA水平、肿瘤部位及神经侵犯相关（P<0.05）。PDHK1高表达组和低表达组的中位生存期分别为13个月和19个月（P=0.037）;PDHK3高表达组和低表达组术后中位存活时间为12个月和19个月（P=0.024）;而PDHK2高表达组和低表达组之间中位生存期无统计学差异（P=0.220）;PDHK4高表达组和低表达组之间的中位生存期差异无统计学意义（P=0.125）。2.CCK8试验显示DADA能浓度依赖性的抑制胆管癌细胞的增殖,经DADA处理48h,半数抑制浓度（IC50）在RBE和QBC939的IC50分别为33mM和18.2mM;DADA可明显上调胆管癌细胞内ROS水平,剂量依赖性诱导胆管癌细胞凋亡,其机制可能是通过调节bc1-2家族相关蛋白促进内源性凋亡的发生,此外5mmol/l N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）联合应用清除ROS可逆转DADA对胆管癌细胞凋亡诱导作用。3.DADA干预后,胆管癌细胞RBE发生G2/M期阻滞,可能是通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶Cdc2的表达而实现的;而对于QBC939细胞发生G0/1期阻滞,可能是通过抑制细胞周期相关蛋白CyclinD1的表达而实现。4.DADA可明显增强PDH活性,并剂量依赖性抑制胆管癌细胞系RBE和QBC939的葡萄糖摄取能力、乳酸及细胞内ATP生成,进一步Western Blotting法结果显示经DADA处理后的胆管癌细胞PDHK1、PDHK2、PDHK3、PDHK4及PDH蛋白表达水平无明显变化,而PDHE1（S293）磷酸化水平随着DADA浓度变化可剂量依赖性降低。5.DADA与顺铂具有协同抑制胆管癌细胞（RBE和QBC939）的增殖能力,协同指数CI<1;DADA明显抑制QBC939移植瘤的生长（P<0.05）,DADA+顺铂联合治疗较单独顺铂治疗对QBC939移植瘤的生长抑制作用更为明显（抑瘤率分别为47.2%和 69.1%,P<0.05）。结论1.PDHK1、2、3及4在胆管癌组织中表达显著增加,其中PDHK1及PDHK3表达水平和患者预后呈负相关,提示其或许可作为胆管癌预后不良的指标。2.DADA可抑制胆管癌细胞增殖,促进胆管癌细胞凋亡,并诱导胆管癌细胞系发生不同时期阻滞,可能和抑制胆管癌细胞的糖代谢相关。DADA与顺铂联用后具有协同抑制胆管癌细胞增殖的作用,在体内实验中能抑制移植瘤的生长,联合顺铂应用可增强胆管移植瘤对顺铂的敏感性。总之,我们的数据提示PDHK在胆管癌的发生发展中起了一定作用,且单纯DADA或联合顺铂治疗或许是未来胆管癌治疗的新策略。