论文部分内容阅读
国兰是我国传统名花,具有重要的观赏价值、经济价值、文化价值和广阔的市场前景。由于国兰中间繁殖体根状茎难分化,国兰种苗生产一直以分株繁殖为主,无法满足市场的需求。本研究以纹瓣兰（Cymbidium aloifolium）、‘小凤兰’（Cymbidium.‘Xiaofeng’）和‘企剑白墨墨兰’（Cymbidium.sinense‘Qijianbaimo’）根状茎为材料,在系统地分析兰花根状茎苗分化特性的基础上,对纹瓣兰根状茎苗分化过程进行转录组测序并筛选出组培快繁相关基因,借助抑制剂Yucasin研究YUCCAs基因调控兰花根状茎苗分化的分子机理,并对YUCCA8基因进行克隆和功能分析。主要研究结果如下:1.在不含外源激素培养基中,光照条件下纹瓣兰根状茎苗分化效率高,其苗分化经历光响应、芽原基诱导、芽分化及生长、根原基诱导和根分化及生长5个阶段;黑暗条件下纹瓣兰根状茎不能分化成苗。2.黑暗条件下形成的纹瓣兰和‘企剑白墨墨兰’根状茎的形态结构是不同的,纹瓣兰根状茎具有鞘叶,见光后迅速分化成苗,而‘企剑白墨墨兰’根状茎没有鞘叶,见光后生长缓慢,难分化。3.在不含外源激素培养基中,黑暗条件下形成的纹瓣兰和‘企剑白墨墨兰’根状茎见光后的内源激素含量动态变化存在显著差异。4.利用Illumina Hiseq 2500平台对纹瓣兰根状茎苗分化的光响应、芽原基诱导、芽分化及生长、根原基诱导和根分化及生长5个阶段的根状茎进行转录组测序,共获得了227,012个unigene。GO和KEGG富集分析结果显示,这些基因主要富集在翻译、糖代谢、折叠/分类/降解、氨基酸代谢以及运输与代谢等方面。差异分析结果显示,纹瓣兰根状茎苗分化过程中光响应阶段差异表达基因（DEGs）数为2654个,主要富集在内质网蛋白加工、光合作用、昼夜节律和植物激素信号转导通路中;芽原基诱导阶段的DEGs为821个,主要富集在糖代谢、氨基酸生物合成、光合作用固碳和苯丙烷生物合成通路中;芽分化及生长阶段的DEGs为893个,主要富集在糖代谢、光合作用固碳和苯丙烷生物合成通路中;根原基诱导阶段的DEGs为1484个,主要富集在糖代谢、氨基酸生物合成、苯丙烷生物合成和细胞周期通路中;根分化及生长阶段的DEGs为1148个,主要富集在糖代谢、光合作用、苯丙烷生物合成和萜类生物合成通路中。5.从纹瓣兰转录组数据中鉴定出13个光响应相关基因（CRY1α、CRY1β、CRY2、CRY3、PHOT1、PHOT2、PHYA,PHYB、PHYC、UVR8、PIF3、COP1、HY5）、10个生长素合成相关基因（2个TAA和8个YUCCA）、22个生长素极性运输相关基因（2个AUX1/LAX、10个PIN/PILS和10个ABCB/PGP）、64个生长素信号转导相关基因（17个Aux/IAA、26个SAUR、6个GH3和15个ARF）、13个细胞分裂素代谢相关基因（3个IPT、2个CYP735A、4个LOG和4个CKX）以及20个细胞分裂素信号转导相关基因（6个CaHK、2个CaHP和12个CaRR）。通过q RT-PCR分析,筛选出31个纹瓣兰根状茎组培快繁相关基因（CRY1β、COP1、YUC2,4,5,7,8,6、LAX2、PIN3,4、ABCB7,8,9、IAA3,4,5,6,9、GH3.4、GH3.6、SAUR3、ARF12,13、LOG1、CaHK1,2,4、CaRR1,2和CaPRR95）,其中YUC2,4,8,6、PIN3,4、ABCB8、IAA5,6、LOG1、CaHK1,2、CaRR1,2和CaPRR95光响应阶段的候选基因,CRY1β和COP1是芽原基诱导阶段的候选基因,YUC7、LAX2、PIN3、ABCB7、ABCB9、SAUR3、IAA6、ARF12、CaHK4和CaRR2是芽分化及生长阶段的候选基因,CRY1β、COP1、IAA3,9、GH3.4和LOG1是根原基诱导阶段的候选基因,YUC5、PIN3、PIN4、IAA3,4,9、GH3.4、GH3.6、SAUR3、ARF13和CaRR2、CaPRR95是根分化及生长阶段的候选基因。6.Yucasin对纹瓣兰根状茎苗分化的抑制作用是通过改变内源激素微环境实现的,Yucasin对根分化的抑制作用可通过添加外源生长素得到恢复,而对芽分化的抑制作用不能通过添加外源生长素而完全恢复。7.50μM Yucasin联合1.0 mg/L 6-BA通过形成一个高浓度DHZ+DHZR、BRs、JA-Me以及低浓度IAA、ABA的内源激素微环境,而显著促进‘企剑白墨墨兰’根状茎芽分化。8.在‘企剑白墨墨兰’根状茎芽分化过程中,15个组培快繁相关基因（YUCCA7,8、LAX2、PIN3、ABCB7,9、IAA3,4,6,9、GH3.4,6、ARF13、CaRR2和LOG1）均显著表达。9.通过SMARTer RACE 5’/3’和同源克隆技术克隆了纹瓣兰、‘企剑白墨墨兰’和‘小凤兰’的YUCCA8的基因,三种兰花YUCCA8基因的编码区序列完全相同,都由3个外显子和2个内含子组成,长度为1497 bp。10.通过Tail-PCR技术克隆纹瓣兰、‘企剑白墨墨兰’和‘小凤兰’YUCCA8基因的启动子序列,获得长度分别为2930 bp,1557 bp和1621 bp的启动子序列,三种兰花YUCCA8基因启动子转录调控元件比较保守,但“转录起始”转录调控元件存在差异。11.构建了兰花YUCCA8基因的过表达载体和CRISPR/Cas9系统并通过农杆菌介导的方法转化‘小凤兰’根状茎,但未获得转基因植株。通过上述研究,初步阐明了兰花根状茎苗分化的分子机理,明确了纹瓣兰根状茎苗分化光响应、芽原基诱导、芽分化及生长、根原基诱导和根分化及生长各阶段时间节点,弄清了纹瓣兰和‘企剑白墨墨兰’根状茎形态结构和内源激素微环境的差异,确定了兰花根状茎组培快繁相关基因,阐述了YUCCAs调控兰花根状茎苗分化的分子机制,获得了兰花YUCCA8基因组及启动子序列,构建了兰花YUCCA8基因的过表达载体和CRISPR/Cas9系统,这为提高国兰种苗工厂化繁殖效率和易快繁品种选育奠定了坚实的基础。