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目的: 铁是多种细菌病理机制中必不可少的物质,在蜡样芽胞杆菌致病过程中也起着重要的调控作用。蜡样芽胞杆菌性眼内炎是外伤后眼内炎最常见也是病情最凶险的类型。典型的临床表现是进展迅速、急骤恶化、眼组织呈咖啡样溶血状或前房可见咖啡样积脓、视网膜毁灭性损害,75%~91%的患者最终丧失视力、行眼球摘除或剜除术。本实验收集了26例蜡样芽胞杆菌性眼内炎患者临床分离菌株,对其在不同铁环境下的生长能力进行检测,并检测不同菌株在不同铁水平下对红细胞、视网膜muller细胞、视网膜色素上皮细胞的毒性作用,建立鼠眼感染模型进行验证,同时结合临床筛选具有代表性的菌株进行全基因组测序,对铁代谢相关基因分型进行检测分析,通过统计分析明确铁代谢相关基因与蜡样芽胞杆菌性眼内炎之间相关性。 方法: 1.收集2011年到2017年于医院就诊的26例研究对象,检测不同菌株在不同铁环境下的生长能力。 2.检测不同菌株的溶血能力。采用LDH乳酸脱氢酶试剂盒检测不同菌株对视网膜muller细胞、视网膜色素上皮细胞的毒性作用。 3.筛选代表性菌株,建立小鼠蜡样芽胞杆菌性眼内炎模型进行验证。 4.结合外伤后蜡样芽胞杆菌性眼内炎患者临床资料、菌株的生长状况和对细胞的毒性作用情况,选取具有代表性特点的不同菌株进行全基因组测序,分析铁代谢相关基因分布状况,并进一步分析铁代谢相关基因分型菌株、外伤后蜡样芽胞杆菌性眼内炎进展的关系。 结果: 1.不同蜡样芽胞杆菌在不同的铁环境中(低铁环境、高铁环境和以血红蛋白为主要铁资源的环境),生长能力存在明显差异。在缺乏铁的环境中,所有菌株的生长能力均受到不同程度的限制作用。26株蜡样芽胞杆菌临床菌株在缺铁的环境中生长能力明显弱于ATCC14579蜡样芽胞杆菌标准菌株。随着低铁培养基中加入的三价铁离子浓度在一定范围内的升高,蜡样芽胞杆菌的生长能力逐渐增强。在以血红蛋白为主要铁资源的环境,不同的蜡样芽胞杆菌中生长能力同样存在明显的差异。其中,菌株B002、B052和B451这3株菌株在以血红蛋白为铁资源的环境中生长能力较强,菌株B002、B052和B451这3株菌株生长能力非常弱。从预后较差的NLP组的患者病灶分离得到菌株与预后较好的LP组患者病灶分离得到的菌株,在LB液体培养基中的生长能力没有明显差异。但是,在以三价铁离子或血红蛋白为主要铁资源的环境中,预后较差组菌株的生长能力明显强于预后较好组。 2.27株蜡样芽胞杆菌菌株,经过铁饥饿处理后,与未经过铁饥饿处理相比,对人红细胞的破坏能力存在明显差异。其中菌株B002、B004、B006、B049、B056、B192、B321、B440、B451、B452、B484、B524这12株菌株经过铁饥饿处理后,对人红细胞的破坏能力明显增强。而菌株B005、B052、B397、B412这4株菌株经过铁饥饿处理后,对人红细胞的溶解能力明显减弱。其余11株菌株,经过铁饥饿处理后与未经过铁饥饿处理后的对人红细胞的溶解能力无明显变化。 3.蜡样芽胞杆菌ATCC 14579标准菌株和7株蜡样芽胞杆菌临床分离株菌株与人视网膜Muller细胞和人视网膜色素上皮细胞进行相互作用,不同菌株对细胞的毒性作用明显不同。对人视网膜Muller细胞的作用,第6小时,除了菌株B460,其余7株菌株在经过铁饥饿处理后,毒性作用有不同幅度的增强,其中B005、B006、B007,这3株菌株在经过铁饥饿处理后,对人视网膜Muller细胞的毒性作用显著性增强;在第8小时,所有菌株在铁饥饿处理组前后,对人视网膜Muller细胞的毒性作用无明显差异。对人视网膜色素上皮细胞的细胞的作用,在第6小时,经过铁饥饿处理后的菌株,对细胞的毒性作用有不同程度地增强,其中菌株B005、B460、B006、B002、B007,这5株菌株在经过铁饥饿处理后,对人视网膜色素上皮细胞的毒性作用显著性增强;在第8小时,菌株B005、B001、B002,这3株菌株在经过铁饥饿处理后对人视网膜色素上皮细胞的毒性作用仍旧显著性增强,其他5株菌株两组之间无明显差异。 4.铁饥饿状态可以促进蜡样芽胞杆菌的致病力,加快小鼠眼内炎的感染进程;铁饱和状态可以抑制菌株的致病力,延缓小鼠眼内炎的感染进程。 5.7株蜡样芽胞杆菌临床分离株具有77个与铁代谢系统相关的基因,包括27个与铁载体系统相关的基因,22个与三价铁离子吸收系统相关的基因,5个与二价铁离子吸收系统相关的基因,9个与血红素+吸收系统相关的基因,5个与铁蛋白相关的基因,5个与铁吸收调控相关的基因,4个其他与铁代谢系统相关的基因。有2个与铁载体系统相关的基因分布存在差异,1个与血红素吸收相关的基因存在差异。 结论: 1.证实了铁是蜡样芽胞杆菌生长的必需元素。对三价铁离子和血红蛋白这些铁资源利用能力强的菌株,所引起的眼内炎患者预后更差。外伤后蜡样芽胞杆菌性眼内炎临床分离株对低铁环境比蜡样芽胞杆菌ATCC14579标准菌株更为敏感不同蜡样芽胞杆菌菌株对三价铁离子和血红蛋白这些不同铁资源的利用能力存在差异。 2.证实了蜡样芽胞杆菌菌体馁的铁水平与对蜡样芽胞杆菌的细胞毒性作用和致病力相关。铁饥饿状态可以促使大部分蜡样芽胞杆菌对人红细胞、人视网膜Muller细胞、人视网膜色素上皮细胞表现出更强的毒性作用。不同蜡样芽胞杆菌菌株对人红细胞、人视网膜Muller细胞、人视网膜色素上皮细胞的破坏能力存在差异。铁饥饿状态可以加强蜡样芽胞杆菌的致病力,而铁饱和状态可以抑制菌株的致病力。铁,是外伤后蜡样芽胞杆菌眼内炎感染过程中的重要影响因素。 3.7株蜡样芽胞杆菌临床分离株具有77个与铁代谢系统相关的基因,其中有2个与铁载体系统相关的基因分布存在差异,1个与血红素吸收相关的基因存在差异。