小分子肽-ScFv αvβ3偶联物在体内、外特异性抑制肺癌细胞生长的研究

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研究背景整合素αvβ3在许多肿瘤中高表达并促进肿瘤进展[1],是肿瘤抗血管治疗的重要靶点[2-5]。其单链抗体(ScFv αvβ3),可在体内、外抑制肿瘤血管形成和肿瘤增殖[6]。与完整的单克隆抗体不同,ScFv仅含有重链和轻链的可变区,保留了原始的抗原结合位点和生物学特性[7],具有分子量小、免疫原性低等优点[8,9]。我们先期发现小分子肽cdGIGPQc可与肺癌细胞表面整合素α3β1特异性结合,将其与ScFv αvβ3结合,构建偶联物cdGIGPQc-ScFv αvβ3,提高ScFv αvβ3与肺癌细胞结合的特异性。目的:利用先期发现的肺癌细胞特异性小分子肽cdGIGPQc,制备ScFv αvβ3结合小分子肽的偶联物,开展临床前期研究,研发一种新型的肺癌特异性靶向治疗药物。内容与方法:1、构建小分子肽cdGIGPQc-ScFv αvβ3偶联物固相合成法(Solid-phase peptide synthesis,SPPS)合成小分子肽 cdGIGPQc及非相关肽cNAQAEQc。原核表达ScFv αvβ3蛋白。SMCC法分别偶联cdGIGPQc-ScFv αvβ3 和 cNAQAEQc-ScFv αvβ3。2、分析cdGIGPQc-ScFv αvβ3与肺癌细胞的结合特性采用免疫荧光和流式细胞技术,分析cdGIGPQc-ScFvαvβ3与肺癌细胞的特异性结合力及亲和性。3、分析cdGIGPQc-ScFv αvβ3的αvβ3抗原结合力及体外抑制细胞增殖作用采用Western Blot实验分析cdGIGPQc-ScFv αvβ3对人整合素αvβ3蛋白的结合能力。CCK-8实验分析cdGIGPQc-ScFv αvβ3对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的增殖抑制作用。4、分析cdGIGPQc-ScFv αvβ3体内抑制肿瘤生长作用构建 NSCLC 裸鼠模型,分析并比较 cdGIGPQc-ScFv αvβ3、cNAQAEQc-ScFvαvβ3、ScFv αvβ3体内抑制肿瘤的作用;处死裸鼠后,取瘤体行免疫组化分析其作用机制。5、cdGIGPQc-ScFv αvβ3 的安全性分析观察给予处理前、后裸鼠的一般情况变化;常规病理学检查,分析处理因素对正常脏器的影响。结果:1、cdGIGPQc-ScFv αvβ3 的构建小分子肽cdGIGPQc及非相关肽cNAQAEQc经ESI-MS、HPLC分析,纯度分别为96.45%和95.08%。纯化的ScFv αvβ3在SDS-PAGE电泳中呈单一条带,cdGIGPQc-ScFv αvβ3、cNAQAEQc-ScFv αvβ3 的分子量略高于 ScFv αvβ3。2、cdGIGPQc-ScFv αvβ3的肺癌细胞结合特性免疫荧光和流式检测显示,cdGIGPQc-ScFv αvβ3和cdGIGPQc可特异结合NSCLC 细胞(约 100%),亲和力明显高于 cNAQAEQc-ScFv αvβ3(约 50%)。3、cdGIGPQc-ScFv αvβ3 的 αvβ3 抗原结合力Western Blot显示,ScFv αvβ3和cdGIGPQc-ScFv αvβ3均能识别并结合整合素αvβ3分子,呈与αvβ3单克隆抗体一致的条带。4、cdGIGPQc-ScFv αvβ3体外抑制肺癌细胞增殖CCK-8实验显示,ScFv αvβ3和cNAQAEQc-ScFv αvβ3具有相似的浓度效应曲线。cdGIGPQc-ScFv αvβ3的IC50值最低,对肺癌细胞的抑制更显著,5 μM浓度下,其抑制率近100%,而前两者仅为40%左右。5、cdGIGPQc-ScFv αvβ3体内抑制肺癌细胞生长裸鼠移植瘤模型中,给予处理后持续观察3周,ScFv αvβ3和cNAQAEQc-ScFv αvβ3的抑瘤效应相近,而cdGIGPQc-ScFv αvβ3的作用更强。cdGIGPQc-ScFv αvβ3组的最终瘤体重量最小,与PBS、ScFv αvβ3和cNAQAEQc-ScFv αvβ3 组比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。cdGIGPQc-ScFvαvβ3组CD31和Ki67免疫组化的IOD/Area值,明显低于ScFv αvβ3和cNAQAEQc-ScFv αvβ3组。CD31、Ki67的同步减少趋势,提示其影响肿瘤血管形成、抑制肿瘤增殖的作用机制。6、cdGIGPQc-ScFv αvβ3 的安全性观察期间裸鼠一般情况良好,体重无明显变化;重要脏器HE染色未见异常。结论:1、cdGIGPQc-ScFv αvβ3偶联物已构建成功。2、cdGIGPQc-ScFv αvβ3偶联物保留了 cdGIGPQc特异结合肺癌细胞的能力。3、cdGIGPQc-ScFv αvβ3偶联物可在体内、外抑制肺癌生长。4、cdGIGPQc-ScFv αvβ3的作用机制是通过影响血管形成,进而抑制肿瘤细胞增殖。5、cdGIGPQc-ScFv αvβ3对正常组织脏器的毒性小,安全性好。
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