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主要研究内容如下:
1.利用RT-PCR和RACE技术克隆了大口黑鲈Myf5 cDNA序列1093bp,其中开放阅读框长723bp,编码240个氨基酸,3’非翻译区长370bp,存在转录终止序列ATTAAA。经分析该蛋白无信号肽序列,属核蛋白,含有一典型的碱性螺旋一环一螺旋结构域。大口黑鲈Myf5基因氨基酸序列与14种脊椎动物相比同源性介于56%-93%之间。其中bHLH结构域与其他鱼类相比同源性可达到90%以上,与人、鼠、牛、鸡、非洲爪蟾相比也有82%以上的同源性,在不同的物种中呈现出较高的保守性,序列高度的保守性与其重要的生物学功能有关。
2.应用高保真PCR技术,设计特异引物分离得到该基因基因组序列,再与已获得的ORF序列进行比对,确认外显子与内含子边界。该基因共存在三个外显子与两个内含子,外显子1、2、3分别长453bp,73bp和197bp。内含子1,2分别长920bp和328bp,内含子与外显子边界均符合GT-AG规则。通过大口黑鲈、条纹鲈、褐牙鲆和斑马鱼的基因组序列比对,我们发现内含子1中存在123bp鱼类中同源性为86%的保守序列,推测它可能在对Myf5基因的时空和组织特异性表达过程中起到调节作用。
3.应用基因组步移(Genome Walker)技术,根据外显子1序列设计引物,分离得到启动调控区2690bp。应用生物信息学软件预测存在基础转录调控元件TATA框、GC框、CCAAT框(核转录因子NFY能对该序列进行调控)和八聚体转录因子1(Otc-1)结合位点。存在与肌肉特异性转录调控相关的元件有E-box 18个、肌细胞特异增强因子2(Myocyte specific enhancer factor2,MEF2)结合位点3个、上游激活因子(Upstream stimulating factor,USF)结合位点2个、血清应答因子(Serum response factor,SRF)结合位点2个、核转录因子sp1结合位点8个、肌肉特异性金属硫蛋白MTBF(Muscle-specific Mt binding site factor)结合位点3个。与早期诱导肌肉分化信号有关的调控元件有早期生长应答因子α(Early growth response gene α,EGRα/TIEG)结合位点、早期快反应生长应答因子1(Early growth response gene 1,Egr-1/Krox-24)结合位点、早期快反应生长应答因子2(Early growth response gene 2,Egr-2/Krox-20)结合位点、生长依赖因子l(Growth factor independence 1)结合位点、T细胞因子TCF/LEF-1结合位点,这些转录因子可能是调控Myf5基因在体节形成期早期表达的主要因子。 4.将Myf5基因的ORF定向克隆至pcDNA3.1(-)/mycHisB载体,构建真核重组表达载体pcDNA3.1(-)/mycHisB-Myf5,溶于生理盐水,肌肉注射法注入罗非鱼右侧背部肌肉作为实验组,左侧背部肌肉注射pcDNA3.1(-)/mycHisB质粒作为对照组,RT-PCR和免疫组化实验证实外源Myf5:mycHis基因已在肌肉组织中局部表达,对照组肌肉组织无外源基因表达。
5.肌注60天后,应用石蜡组织切片技术对实验组与对照组注射部位肌肉组织块进行比较观察,发现实验组白肌肌纤维直径较对照组有显著变化,实验组白肌肌纤维直径平均增大9%,单位面积上肌纤维数量减少,然而红肌的肌纤维密度与直径并无显著变化,是否红肌中的肌肉前体细胞存在不同的信号调控途径有待于进一步研究。结论:过量表达.Myf5基因导致了白肌肌纤维肥大现象,促进了鱼类肌肉的胚后生长。