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目的:构建能够分别表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP蛋白的真核表达质粒,用所构建的真核表达质粒免疫小鼠,检测各质粒的体液免疫和细胞免疫水平,以及攻毒保护率,通过本实验为哺乳动物尤其是老虎H5N1亚型流感病毒核酸疫苗的研究奠定理论与技术基础。方法:应用常规分子生物学方法,构建表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP基因的真核表达质粒pVAX-HA和pVAX-NP;构建同时表达H5N1亚型流感病毒HA基因和猫IL-18基因的双表达质粒pIRES2-IL-18-HA;构建同时表达H5N1亚型流感病毒NP基因和猫IL-18基因的双表达质粒pIRES2-IL-18-NP;应用间接免疫荧光和间接ELASA的方法检测各真核表达质粒在哺乳动物细胞BHK-21中的表达情况;采用肌肉注射的方法,用所构建的四种真核表达质粒免疫小鼠,共免疫3次,每次间隔15天,共设pVAX-HA、pVAX-NP、pVAX-HA和pVAX-NP联合、pIRES2-IL-18-HA、pIRES2-IL-18-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP联合、PBS对照7个免疫组。三次免疫后15天,用间接ELASA的方法检测各组小鼠产生的抗AIV的抗体水平;用MTT法检测各组小鼠产生的细胞免疫水平;用H5N1亚型流感病毒强毒株滴鼻攻毒,检测各组的攻毒保护率。结果:成功的构建了表达虎源H5N1亚型流感病毒HA和NP蛋白的四种真核表达质粒,即pVAX-HA、pVAX-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP;这四种真核表达质粒均能在哺乳动物细胞BHK-21中表达具有生物活性的HA和NP蛋白,均能诱导小鼠产生特异性的细胞和体液免疫;各免疫组小鼠在受到超大剂量(10000MLD50/只)的强毒攻击后,各组免疫保护率分别为:pVAX-HA组60%、pVAX-NP组20%、pVAX-HA和pVAX-NP联合组60%、pIRES2-IL-18-HA组20%、pIRES2-IL-18-NP组0%、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP联合组20%、PBS对照组0%。结论:本实验以H5N1亚型流感病毒HA和NP基因为目的基因,所构建的四种真核表达质粒均能表达出具有生物活性的外源蛋白,并能诱导小鼠产生免疫保护作用,在受到超大剂量(10000 MLD50/只)的强毒攻击后,其中真核表达质粒pVAX-HA的免疫效果最好,可以为小鼠提供60%的保护率。这为哺乳动物H5N1亚型流感病毒核酸疫苗的研究提供了理论与技术基础。