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同源重组和非同源末端连接是修复DNA双链断裂主要的两条途径。同源重组修复过程相对更加复杂,涉及到的蛋白也较多。其中,RPA是同源重组中的关键蛋白之一,能够结合并保护单链DNA(ssDNA),介导细胞周期检查点的激活,参与DNA复制、转录、同源重组以及DNA损伤与修复等DNA代谢过程。Rtt105作为RPA的伴侣蛋白,参与了DNA的复制过程;为进一步了解Rtt105作为RPA伴侣蛋白在细胞其他代谢过程中的功能,我们对其在同源重组修复中的作用和机制进行了探究,得到了以下几个结论:1.Rtt105参与DNA损伤修复。我们通过药物敏感性实验发现RTT105缺失的细胞对DNA损伤药物高度敏感;短时间的药物处理后,与野生型细胞相比,RTT105敲除突变体细胞存活率显著下降,说明Rtt105在DNA损伤应答中发挥重要作用。另外,我们发现RTT105敲除突变体中自发形成的Rad52-YFP聚集点(foci)显著高于野生型细胞,说明突变体细胞中积累大量自发性的DNA损伤;我们还发现Rtt105促进DNA损伤后的恢复,并通过脉冲场凝胶电泳实验进一步确定该结果。2.Rtt105促进同源重组修复DNA双链断裂。我们通过检测DNA双链断裂后细胞利用同源重组进行修复的效率,发现RTT105敲除后同源重组修复效率显著下降,说明Rtt105促进同源重组修复。通过基因打靶实验进一步确定了Rtt105能够促进同源重组过程。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验显示Rtt105会结合到DNA双链断裂末端,这一过程依赖于DNA双链断裂的末端剪切过程,但不依赖于细胞周期的调控。另外,敲除RTT105后会导致酵母人工染色体(YAC)丢失增加,说明Rtt105有助于维持基因组的稳定性。3.Rtt105调控Rfa1的入核定位。我们发现在RTT105敲除突变体中,DNA损伤引起的Rad53磷酸化正常,表明Rtt105不影响细胞周期检查点的激活。利用荧光显微镜,我们观察发现在野生型细胞中,Rfa1基本上完全分布在细胞核中,而在RTT105敲除突变体中,Rfa1在细胞核和细胞质中均有分布,说明Rtt105能够促进Rfa1的入核定位。进一步研究发现在RTT105敲除细胞里,在Rfa1的N端融合入核定位信号序列能够回复Rfa1的入核定位缺陷。RTT105的两点突变(rtt105-E171AL172A)与Rfa1的互作明显减弱,我们发现两点突变并不影响Rfa1的入核定位,但是两点突变中同源重组仍然缺陷,说明Rtt105促进Rfa1入核定位并不依赖和Rfa1的互作;同时也说明Rtt105促进同源重组修复并不主要依赖于其对Rfa1入核定位的影响,暗示了Rfa1-Rtt105互作可能具有其他功能。4.Rtt105促进Rfa1和Rad51在DNA双链断裂末端的结合。我们通过染色质免疫共沉淀实验发现,Rtt105促进Rfa1和Rad51在DNA双链断裂末端结合。两点突变的细胞里Rfa1在DNA双链断裂的末端结合量相比野生型显著下降,说明Rtt105和Rfa1的互作有助于Rfa1结合到DNA双链断裂末端。我们发现在Rfa1融合了入核定位信号序列的RTT105敲除细胞里,能部分回复Rfa1在DNA双链断裂末端的结合缺陷,说明Rtt105调控Rfa1的入核定位也有助于Rfa1在DNA双链断裂末端结合。5.Rtt105的C端促进DNA双链断裂修复。通过荧光显微镜观察Rfa1的入核定位,我们发现Rtt105的C端的155-175这二十个氨基酸对于促进Rfa1的入核定位至关重要;另外,我们发现这一区间对于促进DNA损伤修复和同源重组修复也至关重要。以上结果说明Rtt105通过控制RPA的行为,包括控制RPA的入核定位,帮助RPA在DNA双链断裂末端结合等方式来影响RPA的功能进而影响同源重组修复过程。