脑慢性低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)可以导致脑缺血缺氧,与血管性痴呆及老年相关疾病如阿尔兹海默氏病等多种疾病相关。既往认为白质对缺血具有很高的耐受性,但越来越多的研究表明,脑白质对慢性缺血缺氧的敏感性远高于皮质,特别是富含髓鞘的白质,易引起脱髓鞘,导致轴突的不可逆损害。这可能是认知障碍等脑功能减退的关键结构基础。研究发现神经功能的缺失与供应脑实质的深穿支小动脉以及颈部大动脉及其颅内分支动脉有密切联系,当动脉发生病变或者狭窄时会导致大脑半球深部白质部分血流量下降,持续性的灌流不足可造成白质疏松,从而引起神经功能的缺失,产生具有临床意义的神经症状。脑慢性低灌注导致白质损伤的分子机制缺乏清楚认识。郎飞结(Ranvier node)的近结侧区(juxtaparanode region)粘附分子变化对髓鞘及轴突功能可产生明显作用;在胶质与轴突相互作用中,细胞粘附分子起着重要的联系作用,而胶质/轴突界面变化可引起轴突变性。Caspr2(Contactin-associated protein-2)在轴突与胶质细胞间发生粘附作用,参与构成有髓神经纤维近结侧区,其病变可抑制轴突与胶质细胞的相互作用,继而减慢神经传导速度和改变髓鞘结构,在介导正常髓鞘板层形成及神经冲动的跨节跳跃传导起关键作用。Caspr2结构变化还可引起结区Na+通道、近结侧区K+通道的界限消失,导致白质功能变化。Caspr2在脑慢性低灌注状态下白质损害的作用没有得到研究和认识。所以,本研究在慢性低灌注下,首先观察白质功能改变,包括传导功能、突出运输功能和细胞骨架变化,再进一步探讨Caspr在白质改变中的作用及对离子通道的影响,探讨脑慢性低灌注下白质改变的分子机制。本研究对SD大鼠进行双侧颈总动脉部分狭窄手术建立脑慢性低灌注模型,通过HE染色、电镜观察各组大鼠脑组织的形态学变化,证明符合缺血性改变;利用运动诱发电位方法检测各组大鼠(对照组及术后2周、4周、12周)的轴突传导功能;采用免疫组织化学方法检测慢性缺血大鼠海马CA1区蛋白NF200和Aβ1-40的变化情况;运用免疫荧光、激光共聚焦显微镜及western blot方法观察各组大鼠胼胝体区Caspr2和Na+通道变化情况。对脑慢性低灌注下白质改变的分子机制进行了初步研究和探讨,其结果可能对临床慢性脑缺血导致的脑损伤、认知减退等多种疾病的防治具有重要指导作用。本研究共分三部分:一、脑慢性低灌注动物模型的构建及对脑组织形态学的评价1.方法在无菌技术条件下,利用针线法对sd大鼠的行颈正中切口,分离出双侧颈总动脉。放置注射针头(直径约为1.2mm)于距颈内外动脉交接1.5cm处,用丝线固定颈总动脉与针头,使大鼠双侧颈总动脉部分狭窄,使其出现血流灌注减少,最终形成慢性低灌注,程度可控;维持低灌注状态后2周、4周以及12周,通过he染色,光镜观察各组大鼠脑组织的形态学变化,证明符合缺血性改变;2.结果(1)慢性脑灌注不足大鼠模型,除麻醉意外,无死亡,稳定性和可重复性良好,低灌注程度效果稳定、可靠;(2)大鼠双侧颈总动脉部分结扎后,大脑海马区锥体细胞经历了从最初的缺血、水肿,逐渐发展形成核染色浅淡、严重的神经元脱失和微空泡。这种变化符合慢性持续性脑血流量下降的病理表现,适合脑慢性低灌注实验研究。二、脑慢性低灌注状态下观察白质功能改变,包括传导功能、运输功能和细胞骨架变化1.方法采用运动诱发电位检测各实验组大鼠的运动诱发电位潜伏期变化,观察白质传导功能改变;采用免疫组织化学方法检测大鼠海马ca1区aβ1-40和nf200蛋白表达和分布的变化,了解传输功能改变。2.结果(1)白质传导功能改变:在脑慢性低灌注状态下2周、4周以及12周mep潜伏期显著延长,并随低灌注状态的维持,mep潜伏期延长更为明显,表明脑慢性低灌注导致的脑缺血时轴索传导功能受损,随着低灌注时间推移其传导功能加重恶化。(2)传输功能改变:实验观察到对照组大鼠脑内海马ca1区很少有aβ1-40表达,但nf200表达很明显。脑缺血2周,海马ca1区出现aβ1-40免疫染色阳性细胞,染色较浅,nf200表达比对照组减弱。脑缺血4周,海马ca1区出现较多的aβ1-40免疫染色阳性细胞;nf200表达比脑缺血2周组时还要减弱。脑缺血12周,海马ca1区aβ1-40免疫染色阳性细胞进一步增多;nf200表达仍在减少。结果显示慢性脑灌注不足时轴突传输功能受损,aβ1-40不能通过轴突输送至远端而在胞体聚集,作为细胞骨架蛋白nf200表达降低会导致轴突损害和传输功能改变、轴突变性。三、脑慢性低灌注状态下观察Caspr2、Na+通道蛋白表达变化1.方法采用免疫荧光、激光共聚焦显微镜技术观察粘附分子Caspr2的变化、western blot方法检测Na+通道蛋白表达。2.结果采用免疫荧光、激光共聚焦显微镜技术观察Caspr2在脑慢性低灌注后表达减少,阳性细胞数及染色强度均显著下降,随着低灌注持续时间越长呈现逐渐下降趋势,同时Caspr2的分布模式也发生明显改变,纵行条点状纤维走行出现紊乱,在12周时局部区域出现Caspr2阳性颗粒聚集成团现象。利用western blot方法检测到Na+通道蛋白也有同样进行性下降趋势。提示粘附分子Caspr2在脑慢性低灌注时存在表达变化,Na+通道蛋白表达也降低,Na+通道蛋白表达降低引起Na+内流减弱,影响传导功能。Caspr2这种变化可能是髓鞘分离及髓鞘脱失、Na+通道蛋白表达降低及传导功能减退的重要原因。本研究主要结论如下:采用双侧颈总动脉部分狭窄的方法建立脑慢性低灌注模型,是研究脑白质缺血性损伤病理机制和治疗的较为理想的动物模型之一。脑慢性低灌注影响轴突传导、传输功能。运动诱发电位出现随着缺血时间延长而逐渐延长的趋势;Aβ1-40在胞体聚集,不能传输至轴突远端;NF200表达下降影响轴突结构和传输功能。白质功能改变可能与Caspr2表达降低及分布异常、Na+通道蛋白表达下降有关。粘附分子Caspr2在慢性脑灌注不足时白质损害的病理生理过程中可能起重要作用。