【摘 要】
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研究目的:探究骨髓间充质干细胞调控足细胞骨架蛋白修复的信号通路。方法:1、利用全骨髓贴壁法从SD大鼠股骨中分离BMSCs并培养至P3代,运用体外成骨及成软骨诱导鉴定其功能。2、利用过筛法及IV型胶原酶消化法从SD大鼠肾脏中分离足细胞,并利用免疫荧光检测其特异性蛋白Synaptopodin及Podocin。3、用ELISA法检测BMSCs上清液中EGF含量及其随时间的变化关系。4、设置0.5μg/m
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研究目的:探究骨髓间充质干细胞调控足细胞骨架蛋白修复的信号通路。方法:1、利用全骨髓贴壁法从SD大鼠股骨中分离BMSCs并培养至P3代,运用体外成骨及成软骨诱导鉴定其功能。2、利用过筛法及IV型胶原酶消化法从SD大鼠肾脏中分离足细胞,并利用免疫荧光检测其特异性蛋白Synaptopodin及Podocin。3、用ELISA法检测BMSCs上清液中EGF含量及其随时间的变化关系。4、设置0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml浓度梯度的盐酸阿霉素与足细胞培养作为对照组,另外设置同样阿霉素浓度+10ng/ml EGF的实验组,CCK-8法检测48h内不同时间点各组足细胞活力;5、将分化完全的足细胞分成4个分组:正常组:足细胞阿霉素组:足细胞+盐酸阿霉素（2μg/ml）干细胞组:足细胞+盐酸阿霉素（2μg/ml）+BMSCs（共培养24h）表皮生长因子（EGF）组:足细胞+盐酸阿霉素（2μg/ml）+EGF（10ng/ml）,各实验组干预24h后收集足细胞,利用Western blot法检测各实验组间EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR及Synaptopodin等蛋白的表达情况。结果:1、大鼠BMSCs培养至P3代时镜下观表现为均一梭形结构,呈漩涡状生长,速度快,经成骨诱导及成软骨诱导鉴定后可呈现MSC特征样的显色反应。2、利用差异过筛法从肾脏组织中分离出肾小球足细胞,显微镜下见培养皿中细胞呈鹅卵石样排列,胞体大,表面见不规则足突样隆起。免疫荧光染色显示细胞在特定激发光下显示Synaptopodin和Podocin的荧光。3、BMSCs在体外培养时可向周围环境中释放EGF,后者浓度增长随时间呈先快后慢的趋势,在24-48h左右稳定于12000-13000pg/ml。4、2μg/ml阿霉素作用于足细胞24h时,阿霉素对足细胞的增殖能力抑制最明显,同时10ng/ml EGF刺激足细胞修复的效应也最显著。5、Western blot结果显示:干预24h后,相对于正常组,阿霉素组的p-EGFR、p-AKT、m TOR、p-m TOR及骨架蛋白Synaptopodin灰度值水平均显著下降。干细胞组的各个蛋白灰度值水平也出现不同程度下降,但与阿霉素组比较降低幅度小;EGF组较正常组也出现各蛋白灰度水平下降,变化程度与干细胞组相似。结论:1、全骨髓贴壁法可成功从大鼠股骨中分离并培养出BMSCs,且细胞生长速度快,并具备多向分化潜能,可用于进行体外科研研究。2、差异过筛法及IV型胶原酶消化法可从大鼠肾脏中提取足细胞,并能在体外表达特异性蛋白Synaptopodin及Podocin。3、体外条件下BMSCs与足细胞共培养可修复由阿霉素作用引起的足细胞骨架蛋白Synaptopodin破坏,BMSCs可上调足细胞膜表面EGFR的磷酸化水平,引起一系列下游的相关蛋白包括p-AKT、m TOR及p-m TOR也表现出相同程度的变化,促进细胞蛋白转录与骨架蛋白形成,其作用效果与单纯EGF刺激相似。这一现象揭示了BMSCs可通过分泌EGF激活足细胞EGFR通路促进蛋白转录翻译而发挥抗损伤的作用。
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