禽波氏杆菌病是由禽波氏杆菌(Bordetella avium,B.avium)引起的一种高度接触传染性疫病。近年来的研究表明该病在不同地区的感染率为10%~50%,患鸡群多数生长迟缓,饲料报酬低,对家禽养殖业造成了较大的经济损失 (张绍学,1992; 王晶钰,1997;庄国宏,1998)。在我国该病主要引起鸡胚死亡,孵化率降低,雏鸡的急性死亡(朱瑞良,1991; 朱瑞良,1993)。1周龄内的雏禽最易感,发病雏禽表现为气喘、精神沉郁、饮食欲降低,多数因衰竭或继发其他传染病而导致生长缓慢或死亡;1月龄以上的鸡有一定的抵抗力;成鸡感染后基本无异常表现,为健康带菌,但其所产种蛋带菌,可造成本病的垂直传播。基于病原菌的常规分离、鉴定方法费时费力,2～3d内不能得出准确结果。而标记抗体技术检测方法相比而言具有以下优点:快速、准确;特异性和敏感性超过常规血清学方法;可从粪便、粘膜拭子涂片、病变部渗出物、体液或血液涂片、病变组织的触片或切片中直接检测病原体。为有效地防止该细菌性疾病发生、流行,迅速准确地作出诊断、提出更加有效的防制措施,本课题对禽波氏杆菌病的流行病学规律、B.avium不同分离株的遗传特征作了探索性研究,并建立了相应的标记抗体检测方法,以期为本病的防制提供理论依据和方法指导。本研究共分4部分:一、我国部分地区禽波氏杆菌病的流行病学调查 本研究从广西、河南、山东、安徽等省(自治区)共25 个鸡场采集了801份血清样品,通过直接凝集试验对我国当前禽波氏杆菌(B.avium)病的流行情况进行了血清学调查研究。70日龄以下商品代和父母代肉鸡血清样品326份,B.avium抗体阳性率较低(平均6.44%);70日龄以上父母代肉种鸡血清样品475份,阳性率较高(平均51.79%),其中广西鸡场阳性率平均为26.32%(65/247),河南鸡场阳性率平均为75.63% (121/160),山东鸡场阳性率平均为87.27%(48/55),安徽鸡场阳性率平均为92.31%(12/13)。上述结果显示,该病在我国多个地区已经普遍存在,<WP=8>尤其是父母代种鸡感染率较高。由于本病具有垂直传播性,因此由种鸡感染造成的后果不容忽视,加快该病的致病机理及发生、发展规律的研究已相当重要。二、禽波氏杆菌分离株的G+C mol%测定 Bordetella avium是一种引起禽上呼吸道疾病的病原体,对家禽养殖业造成重要的经济损失。对B.avium不能快速、准确的鉴别阻碍了该病的广泛性调查和彻底的了解其传播机制。 G+C mol%含量测定可作为细菌分类及判定细菌间亲缘关系的依据之一。本研究利用热变性法对5株禽波氏杆菌分离株进行了G+C mol%测定,其范围在61.9～62.9之间。对不同分离株进行G+C mol%含量测定的意义在于,确定其范围,从而为新分离菌株的鉴定提供一个参考标准。 G+C mol%含量测定的意义还在于否定,即G+C mol%含量相同的菌可能是相同的种属,也可能是不同的菌(韩文瑜,1992)。要对一个新的分离株进行分类鉴定,还应进行系统的试验。三、直接荧光抗体法检测禽波氏杆菌的实验研究目前,国外检测禽波氏杆菌的方法有细菌培养鉴定、抗血清凝集、免疫酶标、16S rRNA测序、聚合酶链反应和荧光抗体法等(Blackall P J,1984;Blore P J,1991; Tsai H J,1991;Suresh P,1993;M.M.Kattar,2000)。国内研究较少,主要是细菌培养鉴定、抗血清凝集等;而对禽波氏杆菌感染雏鸡后,在体内不同组织中时间和空间分布的研究还没有。因此,以寻求一种快速、特异,可应用于体内、外检测的方法为目的,进行了直接荧光抗体检测方法的建立。本研究制备了兔抗禽波氏杆菌特异性荧光抗体并建立了直接荧光抗体检测方法,对禽波氏杆菌在感染雏鸡体内的组织分布作了初步研究。结果表明将制备的直接荧光抗体作0.25mg/mL稀释后可见有清晰的特异性荧光,非特异性抗原染色后呈阴性,显示了直接法检测禽波氏杆菌的特异性和灵敏性。禽波氏杆菌的血清型比较简单,不同分离株之间存在交叉反应,因此该方法具有可行性。人工感染实验表明,禽波氏杆菌在鼻窦攻毒后<WP=9>1~3周内主要定植于上呼吸道粘膜,并造成损害;而在其他一些组织中没有分离到该菌。Arp LH(1993),Spers PA(2000)报道,火鸡气管粘膜上存在B.avium糖蛋白受体,本实验结果可能与此有关。禽波氏杆菌主要在上呼吸道定植,但死亡率不高,提示该菌对日龄较大鸡的致病性可能只是作为其他病原微生物感染的一个诱因。因此,对禽波氏杆菌病的致病机理及其防制的研究具有重要意义。四、间接ELISA检测禽波氏杆菌病方法的初步研究 本研究利用禽波氏杆菌p5、p8分离株外膜蛋白作为包被抗原,进行了间接ELISA检测禽波氏杆菌病方法的初步研究。采用超声波破碎法对禽波氏杆菌外膜蛋白进行了提取,利用该外膜蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA检测禽波氏杆菌病方法, 并与DAT(direct agglutination test)检测方法进行了比较。应用该方法对人工免疫及感染条件下鸡血清抗体的消长规律进行了探索。取20只一日龄海兰白雏鸡,分别在14、21日龄油佐剂全细胞灭活苗两次免疫,28日龄攻毒(4×109 CFU/ml滴鼻,0.1ml/只);每周随机采集7份血样,分别用ELISA和DAT检测禽波氏杆菌抗体,并进行比较。对63份血清样品检测结果表明本研究建立的ELISA与DAT方法阳性符合率为73.6%。其中ELISA检测总阳性率为