研究背景肾纤维化,包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化,是慢性肾脏病的普遍特征。许多病理因素,例如慢性持续感染,缺氧,控制不佳的高血压和糖尿病等,均可以引发进行性和不可逆的肾纤维化。其中糖尿病肾病(DN)主要表现为肾小球硬化,其发病机制目前尚不完全明确。高血糖、遗传背景、血流动力学异常等因素均能引起代谢改变、血管活性物质异常,无法精确解析肾纤维化的发生发展过程。因此,积极探索肾纤维化的相关发病机制,并据此研发新的治疗策略一直是研究者努力的目标与方向,其中,缺氧被认为是一个关键因素。最近的研究已经强调了肾内低氧作为慢性肾脏疾病的一个潜在机制。本研究采用单细胞层层组装技术(LBL)成功地构建了体外3D缺氧微环境,以研究miR-382和细胞自噬在肾纤维化中的作用。目的1、基于单细胞LBL技术平台,构建肾系膜细胞的3D缺氧微环境培养体系。2、明确缺氧微环境对肾系膜细胞miR-382以及相关信号通路的影响。3、明确miR-382诱导肾纤维化的相关机制。内容和方法1、利用单细胞LBL组织工程手段构建肾系膜细胞的3D缺氧微环境培养体系。2、采用qRT-PCR法和免疫荧光分析比较研究在2D、3D培养条件下,缺氧微环境对肾系膜细胞miR-382水平及相关信号通路中各种信号分子表达的影响。3、采用免疫荧光和蛋白质印迹分析(westernblotting)比较研究在2D、3D培养条件下,缺氧刺激对肾系膜细胞纤维化的影响,以及miR-382在肾纤维化中所扮演的角色。4、统计学分析采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析,结果用均数±标准差(Mean±SD)来表示。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐时的组间比较采用Tukey法,方差不齐时组间比较采用Dunnett’sT3法,p<0.05认为有显著性差异。结果1、利用单细胞LBL组织工程手段和简单的胰酶消化的方法成功构建了肾系膜细胞的3D缺氧微环境培养体系。2、相比于2D培养体系,3D缺氧微环境培养体系诱导了转化生长因子β1(TGF-β1)和miR-382的高表达,通过下调第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)的表达导致了肾小球硬化。3、在3D细胞(3D球体内细胞)和3DM细胞(从3D球体迁移的细胞)中检测到了细胞自噬的存在。与3D细胞不同,3DM细胞中TGF-β1和纤维连接蛋白(Fn)表达降低,这证明了细胞自噬在肾纤维化中的肾脏保护作用。4、3DM细胞中CD24+细胞的比例增加,我们推测,通过自噬过程存活下来的细胞可能通过去分化获得了祖细胞的一些特征。结论本文通过对透明质酸(HA)的改性,在乙二胺(EDA)和EDC交联的作用下成功合成了带有正电荷的HA-EDA。我们使用带有正电荷的HA-EDA和带有负电荷的HA,通过LBL在单个肾系膜细胞表面形成了超薄膜。这些经过层层组装的单细胞在用胰蛋白酶处理后形成了 3D RMCs多细胞球体。相关实验结果表明,通过这种LBL/胰蛋白酶处理的方法我们成功构建了体外3D缺氧微环境。同时,本研究发现3D球体中的缺氧微环境诱导了肾系膜细胞中TGF-βl和miR-382的高表达,随后通过下调PTEN的表达导致了肾小球硬化。这种LBL组装球体为我们提供了一种灵活而实用的方法来构建缺氧微环境,以研究缺氧对肾纤维化的作用和机制。基于我们开发的3D RMCs多细胞球体,我们还惊奇地发现一些通过自噬、缺氧微环境存活下来的细胞经历了去分化并获得了一些祖细胞的特征。