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大豆作为世界上最为重要的一种经济作物,每年在各个国家都有大宗的贸易份额,在其生长过程中会受到多种真菌、细菌、病毒、线虫、昆虫等病原物的侵染。菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus, BPMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus, TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV)均是危害大豆的重要病毒,也是我国的主要检疫对象,建立其多重PCR的快速检测体系,提高病毒的检测效率,为快验快放服务。本研究以带有BPMV、TRSV和ToRSV的大豆种子为实验材料,根据BPMV、TRSV、ToRSV的CP基因设计合成多对引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证,同时选择大豆内源基因(BD30K)作为参照物,确保RNA提取、cDNA第一链合成及PCR等过程被正确操作,防止假阴性结果的发生。在此基础上合理组合各对引物并调整、优化多重PCR反应条件,最终确立了四对特异性引物和多重PCR的反应条件,选用的引物分别可扩增BPMV 275bp,TRSV 580bp,ToRSV 794bp,BD30K 104bp的特异性片段,反应条件则在普通PCR的基础上调整反应缓冲液浓度至1.4X,BD30K的引物浓度为其他引物的2倍,在此条件下我们建立了同时检测大豆种子中BPMV、TRSV、ToRSV及大豆内源基因BD30K的多重RT-PCR体系。研究结果表明,同步检测的特异性和灵敏度均好;能够检测到BPMV、TRSV、ToRSV和BD30K的RNA最低含量分别为0.9ng、0.186ng、8.0pg、3.8ng;携带三种病毒的大豆种子混合后提取的RNA的最低检测含量为1.16ng。表明建立的多重PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可操作性强,大大缩短了检测时间,简化了操作步骤,具有较强的应用价值,适合口岸对进境大豆种子中这3种病毒的快速检测,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。本研究还建立了大豆种子中BPMV和TRSV单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受2种病毒侵染的大豆种子作为实验样品进行实时荧光PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中,二者的检测限相当,均可达到35 pg/mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。同时将实时荧光灵敏度与DAS-ELISA和RT-PCR检测灵敏度进行比较,结果表明实时荧光PCR检测BPMV和TRSV的灵敏度分别是DAS-ELISA灵敏度的103、106倍;是双重RT-PCR灵敏度的100倍。可见双重实时荧光技术在病毒检测方面有着广阔的应用前景,同时该方法的建立在农业生产、种子流通及种子检验检疫中具有重大意义。