慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种慢性非均质性肺疾病,其特征为持续性的过度炎症,导致组织重塑,肺泡损害,气流受限和肺功能加速下降。吸烟是COPD的主要危险因素。吸入的香烟烟雾(CS)首先遇到呼吸道上皮细胞,引起促炎介质的释放,如白细胞介素(IL)-1,IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)-α。炎症因子通过招募炎症细胞引起肺部浸润,进一步放大炎症并释放蛋白酶和活性氧簇(ROS),从而损害肺实质组织,促进肺气肿的发生。上皮细胞的持续损伤会通过旁分泌影响上皮下成纤维细胞,导致成纤维细胞活化,从而导致过度的细胞外基质沉积和小气道重塑。尽管基于炎症的气道损伤已公认是COPD的核心特征,但其确切的机制尚不清楚。此外,由于COPD的这种异质性也导致至今缺乏有效的治疗措施。微小RNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码RNA(nc RNA)。通过抑制翻译或降解信使RNA(m RNA)来下调基因表达。此外,研究发现miRNA不仅在一种特定的肺部细胞类型中发挥调控作用,还可通过细胞外囊泡(EVs)在不同类型细胞之间主动转运,影响邻近细胞的功能。越来越多的研究发现miRNA在肺部正常生理稳态和肺部疾病发生发展中均具有重要的作用。同时,其在肺病理学中的重要性促进了基于miRNA的治疗策略和生物标志物工具的发展。尽管若干研究已表明吸烟会影响肺部miRNA表达,并在COPD的发展和进程中发挥重要作用,但其确切功能仍有待进一步研究。因此,深入研究miRNA在吸烟所致气道上皮损伤及通过外泌体调控上皮细胞与成纤维细胞间的信号传递中的作用,对于阐明吸烟所致COPD分子机制,寻找吸烟所致肺损伤的早期生物标志和新的治疗靶点具有重要的理论意义和一定的实用价值。第一部分miR-218在CSE所致气道上皮细胞炎症因子及黏蛋白水平升高中的作用目的探讨miR-218调控TNFR1/NF-κB在吸烟所致气道上皮细胞炎症因子及黏蛋白水平升高中的作用。方法使用香烟烟雾抽提物(CSE)处理人支气管上皮(HBE)细胞构建体外暴露模型,应用q RT-PCR检测HBE细胞miR-218及炎症因子IL-6、IL-8的m RNA表达情况;ELISA检测培养液上清炎症因子IL-6、IL-8及黏蛋白MUC5AC水平;western blots检测MUC5AC、TNFR1及p-p65蛋白表达情况;报告基因检测miR-218与TNFR1结合关系;应用穿心莲内酯(Andro)、miR-218 inhibitor或mimic及TNFR1 si RNA或CRISPR/Cas9协同激活介质(SAM)等干预手段探讨miR-218与TNFR1的调控关系及在CSE所致HBE细胞IL-6、IL-8和MUC5AC过表达中的作用。结果一、miR-218在CSE所致HBE细胞炎症因子和黏蛋白水平升高中的作用以及miR-218水平和TNFR1/NF-κB通路的影响用20μg/m L CSE处理HBE细胞0、12、24或48 h,发现miR-218水平逐渐降低,IL-6、IL-8和MUC5AC表达和分泌水平随处理时间的延长而逐渐升高。提示CSE能够引起HBE细胞miR-218水平降低,以及诱导炎症因子和黏蛋白水平升高。分别用50 n M miR-NC或miR-218 mimic转染HBE细胞24h后,再使用20μg/m L CSE处理24 h,发现上调miR-218水平可阻滞CSE所致HBE细胞IL-6、IL-8和MUC5AC表达和分泌水平的升高。提示miR-218在CSE所致HBE细胞炎症因子和黏蛋白水平升高中发挥重要作用。二、miR-218在CSE所致HBE细胞TNFR1/NF-κB通路激活中的作用用20μg/mL CSE处理HBE细胞0、12、24或48 h,发现TNFR1和p-p65表达水平均随处理时间的延长而逐渐升高。提示CSE能够引起HBE细胞TNFR1/NF-κB通路激活。分别用50 n M miR-NC或miR-218 mimic转染HBE细胞24 h后,再使用20μg/m L CSE处理24 h,发现上调miR-218水平后由CSE诱导的TNFR1和p-p65水平升高受到抑制。提示miR-218在CSE所致HBE细胞TNFR1/NF-κB激活中发挥重要作用。miRNA靶基因预测网站分析发现TNFR1 3’-非编码区(UTR)存在miR-218结合位点。分别用50 n M miR-NC/miR-218 mimic与1μg psi CHECK-2-TNFR1-wild/mutant质粒共转染HBE细胞48 h,发现miR-218 mimic与psi CHECK-2-TNFR1-wild共转染组免疫荧光活性明显降低。提示miR-218通过与TNFR1的3’-UTR结合直接调控其表达。三、TNFR1/NF-κB通路在CSE所致HBE细胞炎症因子和黏蛋白水平升高中的作用分别用20 nM Con或TNFR1 siRNA转染预处理HBE细胞24 h后,再使用20μg/m L CSE处理HBE细胞24 h,发现下调TNFR1水平可阻滞CSE所致HBE细胞p-p65表达水平以及IL-6、IL-8和MUC5AC表达和分泌水平的升高。提示TNFR1在CSE所致HBE细胞NF-κB激活及炎症因子和黏蛋白水平升高中发挥重要作用。四、miR-218调控TNFR1在CSE所致HBE细胞炎症因子和黏蛋白水平升高中的作用分别用50 n M miR-NC/miR-218 mimic与2μg Con/TNFR1 SAM质粒共转染HBE细胞24 h后,再使用20μg/m L CSE处理24 h,发现在利用miR-218 mimic上调HBE细胞miR-218水平的基础上联合TNFR1 SAM质粒处理回复TNFR1表达水平后,p-p65、IL-6、IL-8和MUC5AC水平均显著高于miR-218 mimic单独处理组。提示miR-218调控TNFR1在CSE所致HBE细胞NF-κB激活以及炎症因子和黏蛋白水平升高中具有重要作用。五、miR-218调控TNFR1/NF-κB在Andro拮抗CSE所致HBE细胞炎症因子和黏蛋白水平升高中的作用分别用0.05%DMOS或5μM Andro预处理HBE细胞12 h后,再使用20μg/m L CSE处理HBE细胞24 h,发现CSE联合Andro处理组HBE细胞IL-6、IL-8和MUC5AC水平以及TNFR1、p-p65蛋白水平低于CSE单独处理组,miR-218水平高于CSE单独处理组。提示Andro可以阻滞CSE所致HBE细胞炎症因子和黏蛋白水平升高以及miR-218水平降低和TNFR1/NF-κB激活。分别用50 n M miR-NC/miR-218 inhibitor转染HBE细胞12 h后,分别用0.05%DMOS或5μM Andro处理12 h后,再使用20μg/m L CSE处理24 h,发现与CSE联合Andro和miR-218 inhibitor处理组HBE细胞TNFR1、p-p65蛋白水平以及IL-6、IL-8和MUC5AC水平高于CSE联合Andro处理组。提示miR-218在Andro拮抗CSE所致HBE细胞诱导炎症因子和黏蛋白水平升高以及TNFR1/NF-κB激活中发挥重要作用。小结CSE可以引起HBE细胞炎症因子和黏蛋白水平升高,以及可以诱导miR-218水平降低;miR-218通过TNFR1调控NF-κB激活参与CSE所致HBE细胞炎症因子和黏蛋白水平升高;miR-218在穿心莲内酯拮抗CSE所致HBE细胞炎症因子和黏蛋白水平升高中具有重要作用。第二部分miR-21在CSE所致气道成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中的作用目的研究气道上皮细胞分泌的miR-21通过外泌体调控p VHL/HIF-1α介导气道成纤维向细胞肌成纤维分化在吸烟所致气道重塑中的作用和机制。方法使用HBE细胞与人胚肺成纤维细胞(MRC-5)体外共培养模型或利用CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体处理MRC-5细胞,建立体外暴露模型,应用透射电镜检测外泌体形态,western blots检测外泌体标记蛋白;q RT-PCR检测细胞和外泌体miR-21的表达情况;western blots检测MCR-5细胞p VHL、HIF-1α、α-SMA和Collagen I表达水平;报告基因实验检测miR-21与p VHL 3’-UTR结合情况;应用外泌体分泌抑制剂GW4869、miR-21inhibitor或mimic、p VHL si RNA等干涉技术探讨HBE细胞分泌的外泌体miR-21与p VHL/HIF-1α调控关系及在CSE所致MCR-5细胞向肌成纤维细胞分化中的作用。结果一、外泌体在CSE诱导HBE细胞分泌的miR-21转运至MRC-5细胞中的作用HBE细胞分别暴露于0或20μg/mL CSE 12 h后提取外泌体,发现HBE细胞和CSE暴露的HBE细胞均能检测到符合外泌体特征的囊泡;将正常HBE细胞分泌的外泌体(HBE-Exo)或CSE预处理HBE细胞分泌的外泌体(CHBE-Exo)用PKH67标记后处理MRC-5细胞3 h,发现在MRC-5细胞胞质中可检测到PKH67标记的绿色荧光值。提示正常HBE和CSE暴露的HBE细胞可以分泌外泌体并被MRC-5细胞有效摄取。HBE细胞分别暴露于0或20μg/mL CSE 12 h后,提取外泌体。发现CSE暴露组HBE细胞miR-21水平明显升高;CSE暴露组HBE细胞分泌的外泌体中miR-21水平也明显升高。提示CSE能够诱导HBE细胞内miR-21水平被外泌体携带分泌至细胞外。分别用50μg/mL HBE-Exo或CHBE-Exo处理MRC-5细胞24 h,或将HBE细胞或CSE预处理HBE(CHBE)细胞与MRC-5细胞共培养,发现CHBE-Exo处理组MRC-5细胞和与CHBE细胞共培养的MRC-5细胞miR-21水平明显升高;进一步用GW4869抑制外泌体分泌,发现与CSE联合GW4869处理HBE细胞共培养组MRC-5细胞miR-21水平明显降低。提示CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体可以递送miR-21至MRC-5细胞。二、CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体miR-21在肌成纤维细胞分化中的作用分别用50μg/mL HBE-Exo或CHBE-Exo处理MRC-5细胞24 h,或将HBE细胞和CHBE细胞与MRC-5细胞共培养24h,发现CHBE-Exo处理组及与CHBE细胞共培养组MRC-5细胞α-SMA和Collagen I表达水平明显升高;进一步用GW4869抑制外泌体分泌,发现与CSE联合GW4869处理HBE细胞共培养组MRC-5细胞α-SMA和Collagen I表达水平明显降低。提示CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体可以促进MRC-5细胞向肌成纤维细胞分化。HBE细胞分别用miR-NC或miR-21 inhibitor转染24 h后,暴露于20μg/mL CSE 12 h,发现CSE联合miR-21 inhibitor处理HBE细胞分泌的外泌体(anti-miR-21-CHBE-Exo)miR-21水平明显降低;进一步用50μg/m L CHBE-Exo、anti-miR-21-CHBE-Exo或anti-miR-NC-CHBE-Exo分别处理MRC-5细胞24 h,发现anti-miR-21-Exo处理组MRC-5细胞α-SMA和Collagen I水平明显降低。提示CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体miR-21在MRC-5细胞向肌成纤维细胞分化中发挥重要作用。三、CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体miR-21对MCR-5细胞p VHL/HIF-1α通路的影响分别用50μg/m L HBE-Exo或CHBE-Exo处理MRC-5细胞24 h,发现CHBE-Exo处理组MRC-5细胞p VHL水平降低、HIF-1α水平升高。提示CSE诱导HBE细胞释放的外泌体可以影响MRC-5细胞中p VHL/HIF-1α表达水平。miRNA靶基因预测网站分析发现miR-21与p VHL 3’-UTR存在碱基互补配对结合位点。分别将1μg psi CHECK-2-p VHL-wild/mutant质粒和50 n M miR-NC/miR-21 mimic共转染MRC-5细胞48 h,或分别用1μg psi CHECK-2-p VHL-wild或psi CHECK-2-p VHL-mutant质粒转染MRC-5细胞后24 h,再用HBE-Exo或CHBE-Exo处理24 h,发现psi CHECK-2-p VHL-wild与miR-21 mimic共转染组免疫荧光活性明显降低;CHBE-Exo联合psi CHECK-2-p VHL-wild处理组免疫荧光活性也明显低于psi CHEDCK-2-p VHL-wild单独转染组。提示CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体miR-21通过与p VHL的3’-UTR结合而抑制其在MRC-5细胞中表达。分别用50μg/m L CHBE-Exo、anti-miR-21-CHBE-Exo或anti-miR-NC-CHBEExo处理MRC-5细胞24 h,发现anti-miR-21-CHBE-Exo处理组MRC-5细胞p VHL水平升高、HIF-1α水平明显降低。进一步用20 n M Con或p VHL si RNA转染预处理MRC-5细胞24h后,再予以上述相同处理,发现anti-miR-21-CHBE-Exo联合p VHL si RNA处理组MRC-5细胞p VHL水平降低、HIF-1α水平明显升高。提示CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体miR-21通过p VHL调控HIF-1α在MCR-5细胞的表达。四、CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体miR-21通过p VHL调控HIF-1α在肌成纤维细胞分化中的作用用20 nM Con或pVHL siRNA转染预处理MRC-5细胞24 h后,分别暴露于CHBE-Exo或anti-miR-21-CHBE-Exo 24 h,发现anti-miR-21-CHBE-Exo联合p VHL si RNA处理组MRC-5细胞α-SMA和Collagen I水平明显升高。提示CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体miR-21通过p VHL调控MCR-5细胞向肌成纤维细胞分化。分别用20n M Con或HIF-1αsi RNA转染预处理MRC-5细胞24 h后,再暴露于CHBE-Exo 24 h,发现CHBE-Exo联合HIF-1αsi RNA处理组MRC-5细胞HIF-1α、α-SMA和Collagen I水平均明显降低。提示HIF-1α在CSE诱导HBE细胞分泌的外泌体所致MCR-5细胞向肌成纤维细胞分化中具有重要作用。小结CSE可以引起HBE细胞miR-21水平升高,并可通过外泌体转运至MRC-5细胞;外泌体miR-21通过p VHL调控HIF-1α在诱导MRC-5细胞激活和分化中发挥重要作用。第三部分miR-218和miR-21在CS暴露诱导小鼠气道损伤中的作用目的分别探讨miR-218在穿心莲内酯拮抗吸烟所致气道炎症和黏液高分泌中的作用及靶向沉默miR-21对吸烟所致气道重塑的影响。方法将6-8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为对照(Con)组、香烟烟雾(CS)组、CS联合DMSO组及CS联合Andro组,建立CS诱导小鼠气道炎症及黏液高分泌及干预模型。对照组暴露于空气中;其余各组小鼠暴露于500 mg/m3总颗粒物(TPM)浓度CS,持续4周;干预组小鼠腹腔注射Andro或DMSO。肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及分类计数检测炎症情况;q RT-PCR检测肺组织miR-218水平及IL-6和IL-8 m RNA水平;western blots检测肺组织MUC5AC、TNFR1及p-p65表达水平;ELISA检测BALF上清IL-6、IL-8和MUC5AC水平。将6-8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为Con组、CS组、CS联合anti-miR-21组及CS联合anti-miR-NC组,建立CS诱导小鼠气道重塑及干预模型。对照组暴露于空气中;其余各组小鼠暴露于500mg/m3 TPM浓度CS,持续8周;干预组小鼠尾静脉注射antagomir-21或antagomir contorl。whole-body plethysmography检测肺功能;Masson Trichrome染色检测胶原纤维增生情况;q RT-PCR检测肺组织miR-21表达水平;western blots检测肺组织p VHL、HIF-1α、α-SMA和Collagen I蛋白表达水平。结果一、CS暴露对小鼠气道炎症水平和黏液分泌以及miR-218水平和TNFR1/NF-κB通路的影响将小鼠分别暴露于空气或CS 4周后,发现CS组小鼠BALF中细胞总数和炎症细胞数量增加,以及BALF和肺组织中IL-6、IL-8和MUC5AC的水平明显升高;肺组织中miR-218水平降低,而TNFR1和p-p65表达水平明显升高。提示CS暴露可以引起小鼠气道炎症反应和黏液分泌增加,以及引起小鼠肺组织miR-218水平降低和TNFR1/NF-κB激活。二、Andro对CS暴露所致小鼠气道炎症反应和黏液高分泌以及miR-218水平降低和TNFR1/NF-κB激活的影响分别将Con组、CS组、CS联合DMSO组和CS联合Andro组分别暴露于空气或CS 4周后,发现CS联合Andro组小鼠BALF中细胞总数和炎症细胞数量减少,BALF和肺组织中IL-6、IL-8、MUC5AC水平明显下降;肺组织miR-218水平明显升高,TNFR1和p-p65水平明显下降。提示Andro能够拮抗CS暴露所致小鼠气道炎症反应和黏液高分泌以及miR-218水平降低和TNFR1/NF-κB激活。三、CS暴露对小鼠肺功能和气道结构以及miR-21水平和p VHL/HIF-1α通路的影响小鼠分别暴露于空气或CS 8周后,发现CS组小鼠气道高反应性增强,气道壁增厚、胶原纤维增生明显,且肺组织α-SMA和Collagen I表达水平明显升高;小鼠肺组织miR-21水平和HIF-1α水平升高,而p VHL水平下降。提示CS暴露可以引起小鼠气道重塑以及miR-21水平升高和p VHL/HIF-1α通路的激活。四、miR-21在CS暴露所致小鼠气道重塑以及p VHL/HIF-1α通路激活中的作用分别将Con组、CS组、CS联合antagomir-21组、CS联合antagormir-control组小鼠暴露于空气或CS 8周后,发现CS联合antagomir-21组小鼠肺组织miR-21水平和HIF-1α水平降低,而p VHL水平上升;气道高反应性降低,气道胶原纤维增生水平下降,肺组织α-SMA和Collagen I水平下降。提示抑制miR-21水平能够拮抗CS暴露所致小鼠p VHL/HIF-1α通路激活以及气道重塑。小结小鼠全身暴露CS 4周可引起气道炎症反应和黏液高分泌,以及肺组织miR-218水平降低及TNFR1/NF-κB通路激活;穿心莲内酯可上调miR-218水平,并拮抗CS所致气道炎症反应及黏液高分泌。小鼠全身暴露CS 8周可引起肺功能降低,气道胶原纤维增生,以及肺组织miR-21和HIF-1α水平升高;使用antangomir-21下调miR-21水平,可阻滞CS所致小鼠气道重塑。第四部分miR-218和miR-21在吸烟及COPD人群血清中水平及意义目的探讨血清miR-218和miR-21在非吸烟者、未患COPD吸烟者和吸烟COPD患者之间的表达差异及意义。方法在已建立的COPD监测人群队列中随机选择非吸烟者、未患COPD吸烟者和吸烟COPD患者作为研究对象;流行病学调查收集基础资料及吸烟史;支气管舒张后检测肺功能,q RT-PCR检测血清miR-218、miR-21表达水平。结果一、吸烟对肺功能的影响分别对非吸烟者、未患COPD吸烟者和吸烟COPD患者吸入沙丁胺醇气雾剂后进行肺功能检测,发现未患COPD吸烟者FEV1/FVC(%)相比于非吸烟者明显降低。提示吸烟可引起肺功能下降。二、吸烟对血清miR-218和miR-21水平的影响分别收集非吸烟者、未患COPD吸烟者和吸烟COPD患者血清,检测发现相比于非吸烟者和未患COPD吸烟者,吸烟COPD患者血清miR-218水平明显降低,而miR-21水平明显升高;未患COPD吸烟者血清miR-218和miR-21水平与非吸烟者相比均差异表达。提示吸烟和COPD发生可引起血清miR-218水平降低和miR-21水平升高。三、血清miR-218和miR-21与肺功能的相关性分别对非吸烟者、未患COPD吸烟者和吸烟COPD患者血清检测miR-218和miR-21水平与FEV1/FVC(%)进行线性回归分析,发现miR-218水平与FEV1/FVC(%)呈正相关关系,miR-21水平与FEV1/FVC(%)呈负相关关系。提示血清miR-218水平降低和miR-21水平升高与吸烟所致肺功能降低有关。小结吸烟会引起肺功能下降;吸烟和COPD发生会引起血清miR-218水平下降和miR-21水平升高;血清miR-218和miR-21水平改变与肺功能存在相关关系。综上所述,本研究主要发现:1.CSE可引起HBE细胞miR-218水平降低,并通过TNFR1激活NF-κB而导致炎症因子及黏蛋白水平升高;Andro则通过上调miR-218水平拮抗CSE所致HBE细胞炎症因子及黏蛋白水平的升高。2.CSE可引起HBE细胞miR-21水平升高,并通过外泌体转运至MRC-5细胞后,miR-21通过p VHL调控HIF-1α诱导MRC-5细胞向肌成纤维细胞分化。3.CS暴露可引起小鼠气道损伤,以及肺组织miR-218水平降低和miR-21水平升高;Andro可能通过上调miR-218水平而拮抗CS暴露所致气道炎症和黏液高分泌;下调miR-21水平则可阻滞CS暴露所致小鼠气道重塑。4.吸烟可引起人群肺功能降低,血清miR-218水平降低和miR-21水平升高,且血清miR-218降低和miR-21水平升高分别与肺功能降低呈正相关和负相关关系。