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肌肉和骨骼在骨质疏松、肌少症等疾病中往往同步变化,存在密切联系。相邻肌骨之间存在正反馈的回路机制,以通过分泌调控因子相互调节,并且在细胞水平存在细胞间信号传导,但均属于分泌蛋白。外泌体作为一种由细胞分泌的囊泡,可以介导多种活性分子进入受体细胞发挥调控作用。其中,外泌体对miRNA有浓缩作用,且外泌体膜结构可以保护miRNA免受RNA酶的降解,功能性miRNA具有多靶点调控效应。已有研究表明外泌体可以介导功能性miRNA进入受体细胞发挥调控作用。但目前以外泌体的角度阐述肌骨间相互作用的研究尚未见报道。目的:本研究旨在明确成肌细胞外泌体对成骨细胞成骨分化的促进作用,并对其介导miRNA促成骨分化的作用机制作进一步探索,为骨组织工程的研究和相关疾病治疗提供新的思路和理论依据。方法:(1)提取成肌细胞C2C12细胞外泌体,采用透射电镜和Western blot法从形态学和分子生物学两方面对其进行鉴定。(2)为检测C2C12细胞外泌体对MC3T3-E1细胞矿化能力的影响,示踪实验确定外泌体进入到细胞,MC3T3-E1细胞中加入提取得到的外泌体继续培养,构建成骨诱导模型,茜素红染色、ALP活性检测、实时荧光定量PCR检测成骨标志基因以鉴定模型建立。(3)高通量测序筛选出主要调节miRNA,瞬时转染下调C2C12细胞内miRNA表达,实时荧光定量PCR验证瞬时转染效果。(4)为验证成肌细胞来源外泌体中miR-27a-3p对MC3T3-E1细胞矿化能力的影响,提取瞬时转染后外泌体,再次构建MC3T3-E1细胞矿化模型,通过茜素红染色、ALP活性检测等不同成骨分化指标的检测,验证其对成骨诱导模型的影响。(5)为验证外泌体中miR-27a-3p表达量改变对受体细胞β-catenin信号通路的影响,Western blot检测APC和β-catenin蛋白的表达,免疫荧光检测β-catenin蛋白核转移情况。结果:(1)透射电镜观察发现外泌体直径在30-100nm之间;Western blot结果显示提取得到的外泌体均表达CD9、CD63和CD81标记蛋白。(2)示踪结果显示外泌体进入细胞并富集在细胞核周围;茜素红染色结果显示加入外泌体诱导培养后产生了大量明显的矿化结节;ALP活性检测结果显示,加入外泌体诱导培养后ALP活性明显上调,且具有时间依赖性;实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,成骨标志基因ALP、OCN和Runx2表达升高。(3)高通量测序结果筛选出发挥调控作用的miRNA即miR-27a-3p;实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,瞬时转染72小时后,C2C12细胞和外泌体miR-27a-3p含量明显下调;提取瞬时转染后的外泌体,和受体细胞培养48小时后,miR-27a-3p表达量与对照组无明显差异。(4)与对照组相比,C2C12细胞转染inhibitor来源外泌体组在茜素红染色、ALP活性和实时荧光定量PCR等指标结果均无显著差异,与正常C2C12细胞来源外泌体组相比有显著差异。(5)Western blot和免疫荧光结果显示,正常C2C12细胞来源外泌体组APC表达显著降低,β-catenin蛋白表达明显上调,核转移增多;C2C12细胞转染inhibitor来源外泌体组与对照组相比,APC和β-catenin蛋白表达量无显著差异。结论:成功提取成肌细胞外泌体,实验结果表明成肌细胞外泌体可以促进成骨细胞的成骨分化;通过改变外泌体miR-27a-3p含量,建立成骨分化模型,经成骨表型验证,确定miR-27A经外泌体介导进入成骨细胞内,发挥促成骨分化作用,并证明成肌细胞外泌体介导miR-27a-3p通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥促成骨分化作用。本研究首次证实可以从外泌体的角度解释成肌细胞对成骨细胞的调节作用,并且这种作用是通过miR-27a-3p直接调控APC/β-catenin信号通路实现的。