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本试验以38日龄杜长大仔猪(断奶后2周)为试验对象,研究四种锌源(硫酸锌、甘氨酸锌、蛋氨酸锌、氧化锌)对仔猪生长性能、抗氧化、组织元素沉积及肠道形态的影响,探讨锌吸收相关转运蛋白表达的差异,进一步通过细胞试验,以猪肠上皮细胞IPEC-J2为模型,研究不同锌源对细胞增殖、氧化应激、线粒体功能的影响,评估各锌源的生物安全性。 试验分以下两部分进行: 试验一 不同锌源在仔猪上的生物学效应研究 以38日龄杜长大仔猪(8.55±0.39kg)为研究对象,随机分为5个处理(每个处理4个重复,每个重复10头猪)。对照组饲粮不外源添加锌源,试验组饲粮分别添加100mg/kg的ZnSO4、Zn-Gly和Zn-Met以及2250mg/kg的ZnO(以锌计),试验期35天后屠宰,取血清、肝脏、肠道组织测定相关指标。主要研究结果如下: 1.不同锌源对仔猪生长和血液学相关指标的影响 与对照组相比,100mg/kg Zn-Gly与2250mg/kg ZnO显著提高了平均日增重和料重比,并降低了腹泻率(P<0.05)。添加100mg/kg锌源各组的腹泻率与高剂量ZnO组并无显著性差异(P>0.05)。对照组白细胞计数和嗜碱性粒细胞绝对值显著高于100mg/kg锌源组(P<0.05)。与对照组和ZnSO4组相比,Zn-Gly和高剂量ZnO显著提高了红细胞计数、血红蛋白和红细胞压积(P<0.05)。 2.不同锌源对仔猪组织元素沉积的影响 高剂量ZnO组血清、肝脏和胫骨锌含量均显著高于对照组(P<0.05),且Zn-Gly组在数值上也要优于ZnSO4组和Zn-Met组(P>0.05)。高剂量ZnO组粪锌含量显著高于其他处理组(P<0.05),而Zn-Gly组与对照组在粪锌含量上差异不显著(P>0.05)。 3.不同锌源对仔猪抗氧化功能的影响 与对照组相比,ZnO显著提高了血清AKP活性,Zn-Gly显著提高了血清Cu/Zn SOD活性(P<0.05)。Zn-Gly在数值上提高了血清T-AOC与GSH-Px活性,但各组间差异不显著(P>0.05)。对照组NO含量显著高于有机锌组和高剂量ZnO组,而MDA含量在ZnO组达到最高(P<0.05)。 与对照组相比,100mg Zn/kg有机锌与高剂量ZnO显著提高肝脏AKP酶活性(P<0.05)。外源添加锌显著提高了肝脏GSH-Px酶活性(P<0.05)。相比其他各组,2250mg Zn/kg ZnO显著提高肝脏T-AOC。有机锌显著降低肝脏MDA含量,对照组和高剂量ZnO组NO含量显著高于100mg Zn/kg锌源组(P<0.05)。 4.不同锌源对仔猪肠道形态的影响 与对照组相比,添加锌源显著提高十二指肠绒毛高度以及绒毛高度和隐窝深度比值,2250mg Zn/kg ZnO显著降低十二指肠隐窝深度(P<0.05)。对照组空肠隐窝深度显著高于添加锌源组(P<0.05)。 5.不同锌源对仔猪肠道锌吸收相关转运蛋白表达的影响 与对照组相比,高剂量ZnO显著提高了十二指肠和空肠MT1mRNA水平(P<0.05),Zn-Gly显著提高了空肠MT1mRNA水平(P<0.05)。100mg Zn/kg各锌源组十二指肠MT1mRNA与对照组相比均有升高的趋势但差异不显著。 高剂量ZnO相比对照组显著降低了十二指肠和空肠ZIP4mRNA表达(P<0.05)。100mg Zn/kg有机锌显著降低了十二指肠ZIP4mRNA水平,ZnSO4显著降低了空肠ZIP4mRNA水平(P<0.05)。 试验二 不同锌源对IPEC-J2细胞损伤的影响 以猪空肠上皮细胞IPEC-J2为模型,研究不同锌源(ZnSO4、Zn-Gly、Zn-Met和ZnO)、不同锌浓度(100,150,200,250和300μmol/L)和不同培养时间(2h、4h和6h)IPEC-J2细胞活性;在此基础上,选择200μmol/L(以锌计)的四种锌源处理细胞4h,细胞染色,测定GSH、MDA和Ca2+-ATP酶活性,荧光探针和流式细胞仪测定胞内ROS水平以及线粒体膜电位变化情况。结果表明: 1.不同锌源对IPEC-J2细胞增殖活性的影响 100μmol/L各锌源处理6h后均对细胞活性无显著影响(P>0.05)。150、200、250和300μmol/L各锌源处理细胞,细胞活性均随锌浓度的升高而降低,且有机锌对细胞的损伤小于ZnSO4和ZnO。当锌浓度>250μmol/处理6h后各组细胞活性均小于50%。 2.不同锌源对IPEC-J2细胞氧化应激的影响 添加锌源后胞内ROS含量升高,无机锌ROS含量显著高于有机锌组,在ZnO组最高,且GSH含量在添加锌源组出现明显下降(P<0.05),各锌源间相比,Zn-Gly组GSH含量显著高于其余各组(P<0.05)。添加锌源后均显著升高了胞内MDA含量(P<0.05),且Zn-Gly组MDA含量显著低于无机锌组。 3.不同锌源对IPEC-J2细胞线粒体功能的影响 与对照组相比,添加锌源各组均显著降低了线粒体膜电位,呈现出高绿低红,且Zn-Gly组线粒体膜电位与对照组差异不显著。添加锌源后显著降低了细胞内Ca2+-ATP酶活性(P<0.05)。 综上所述,添加不同锌源均有效改善了仔猪机体锌状态。同等剂量下,有机锌在仔猪生长、元素沉积与吸收、抗氧化及肠道形态优于ZnSO4。高剂量氧化锌在仔猪断奶后期仍具有一定的促生长作用,但在氧化还原平衡上存在潜在的负面作用。 细胞试验表明,锌浓度大于200μM的不同锌源均会导致细胞活性降低,且有机锌尤其甘氨酸锌组细胞存活率高于无机锌。200μM锌处理4h发现胞内ROS含量显著升高,脂质过氧化物生成,消耗还原型GSH,同时破坏线粒体膜电位,降低ATPase酶活性,导致细胞损伤,且无机锌对细胞损伤程度更大。