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猪圆环病毒2型(PCV2)可以引起一系列相关疾病,统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD),临床典型的有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)等。PCV2还可以破坏猪体免疫系统,引起猪细小病毒病、副猪嗜血杆菌病、巴氏杆菌病等疾病的混合或继发感染,给养猪业带来了巨大的经济损失。Cap蛋白由病毒基因ORF2编码,是PCV2的主要结构蛋白,具有PCV2的主要抗原表位,是PCV2疫苗和诊断试剂研究的主要靶向抗原。目前,我国已经研制成功PCV2灭活疫苗,但安全性和免疫效力还不十分理想。本研究研制比较了PCV2疫苗用新型复合水佐剂,并且尝试用毕赤酵母表达PCV2 Cap蛋白,为未来廉价PCV2疫苗研制奠定了基础。具体研究内容如下：1、PCV2灭活疫苗新型水佐剂研制本研究以水性高分子聚合物卡波姆(CP)为基础,首先通过添加适量H和T蛋白,配置成两种水溶性佐剂CPH和CPT,小鼠免疫试验结果显示,CPH佐剂可以明显增强PCV2灭活抗原抗体水平。然后以CP为基础,添加不同剂量的H蛋白,并以商品化的ISA206和Gel佐剂为对照,制成PCV2灭活疫苗,小鼠免疫试验结果显示,CP中添加0.8mg/mL的H蛋白的CPH佐剂可以明显增强PCV2抗原免疫特性,其抗体水平与ISA206组相似。PCV2-CPH、PCV2 Cap-CPH水佐剂与PCV2-ISA206灭活疫苗猪体免疫结果显示,三者免疫抗体水平相似,并均可抵抗PCV2强毒攻击,免疫效力相似。CPH佐剂成本低廉、制作简便、副反应小,在PCV2灭活疫苗的应用方面有巨大潜力。2、PCV2Cap蛋白在毕赤酵母中的表达本研究以酵母偏嗜密码子优化的PCV2 Cap基因(Capo)为模板,采用PCR方法分别构建了包含完整序列的Cap蛋白(Capo)和删除核定位序列(NLS)的Cap蛋白(Cap△ NLS)的重组酵母表达载体,电转化入GS115菌株后筛选到可以分泌表达目的蛋白的重组酵母菌株GS115/pPIC9K-Capo和GS 115/pPIC9K-Capo △ NLS, SDS-PAGE结果显示,分泌表达产物Capo和Capo△NLS大小分别约43kd和27kd,Capo蛋白比预期蛋白分子量大10kd左右,说明NLS影响了Cap蛋白在酵母菌中的分泌,而删除NLS的Cap蛋白与预期大小相符,并可以得到很好的分泌表达。Western-blot结果证实,无论是否删除NLS,酵母表达的Cap蛋白都具有PCV2的抗原特性,电镜结果显示,仅Capo蛋白可以形成病毒样颗粒。从而为PCV2重组Cap蛋白亚单位疫苗研究奠定了一定基础。3、酵母表达Cap蛋白免疫特性本研究首先用夹心ELISA方法鉴定了毕赤酵母表达的Cap蛋白的抗原性,结果显示,酵母表达Capo蛋白具有PCV2抗原特性,删除NLS后其抗原性降低。将CPH水佐剂分别与毕赤酵母表达的Cap蛋白、杆状病毒表达系统表达的Cap蛋白及灭活PCV2制备水佐剂灭活疫苗,进行小鼠免疫试验,结果为：4种不同疫苗免疫后均可诱导机体产生高水平的PCV2特异性抗体,但是,Capo△NLS+CPH组诱导的中和抗体水平最低,表明PCV2的中和抗体可能与NLS有关,从而为PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗分子设计提供了基础。