目的:　　肺癌是最常见于支气管粘膜上皮组织的恶性疾病，也被称为支气管肺癌。全球，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首。同时，由于缺乏有效的早期发现手段，中晚期病例治疗花费大且收获小，使得肺癌防治成为癌症防治的重中之重、难中之难。我国肺癌的发病率和死亡率一直呈明显上升趋势，预计到2025年，我国每年因肺癌致死的人数将达到数百万。肺癌的防治工作已经给我国带来了沉重的经济和社会负担，每年造成的经济损失保守估计超过百亿元。　　肺癌包括非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC，约占85％）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC，约占15％）。SCLC源自神经内分泌细胞，而NSCLC则源于肺上皮细胞。吸烟被认为是肺癌发生发展的主要诱因（80％～90％的肺癌与吸烟相关）。目前，香烟烟雾中已被证实含有4000多种化学物质，其中，已有60多种被确定为致癌物质或者协同致癌物质。香烟中含有的多环芳烃类化合物苯并芘(B[a]P)及其代谢产物B[a]PDE是目前发现的最为明确的致肺癌化合物，研究数据表明B[a]P能够通过诱导支气管细胞发生炎症反应，进而产生较强的致癌效应，但具体作用机制尚不明确。　　沉默信息调节因子1(silent information regulator1，SIRT1)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的组蛋白脱乙酰化酶，能够使多种蛋白质发生去乙酰化作用，进而参与到细胞迁移/侵袭、基因表达调控以及恶性转化等多种生物学功能的调控过程中。研究显示SIRT1可能通过影响系统免疫炎症和细胞老化进程，从而作用于细胞增殖以及恶性转化的炎症微环境，最终影响到肿瘤的发生和发展。然而，对于SIRT1在肿瘤发生发展中的作用及其机制尚未阐述清楚。　　本课题的研究有助于了解SIRT1通过TNF-α/β-catenin转导通路，调控B[a]P诱导肺癌发生发展的分子机制;有助于研发以SIRT1等作为靶点，防治肺癌的新药物。　　方法:　　1.SIRT1在人肺部组织中的表达量:　　研究人员从温州医科大学附属第一医院收集相关肺部组织临床标本，利用免疫组织化学技术检测SIRT1的表达量，并对相关数据进行统计学分析。　　2.B[a]P暴露下，BEAS-2B细胞和小鼠肺部组织中SIRT1的表达水平:　　将人支气管上皮细胞BEAS-2B暴露于8μM B[a]P环境下不同时间点，分别利用蛋白质免疫印迹和RT-PCR实验检测SIRT1蛋白质和mRNA的表达水平;将野生型雌性C57BL/6小鼠进行支气管灌注B[a]P（1 mg/mice，溶于50μl的三辛酸甘油酯），每周一次，连续四周。对照组C57BL/6小鼠同样频率下灌注等体积的三辛酸甘油酯。分别在B[a]P灌注后第1d、第30 d、第60 d、第90 d、第120 d、第150 d，处死5只小鼠，第180 d处死30只小鼠。利用HE染色检测小鼠肺部组织的病理学改变，利用免疫组织化学技术检测SIRT1及其炎症相关细胞因子COX-2、TNF-α、NF-κB等蛋白质的表达水平。　　3.B[a]P暴露下，SIRT1对BEAS-2B细胞迁移和侵袭的影响:　　研究利用Lipo2000转染试剂，将特异性干扰SIRT1蛋白表达的SIRT1-pGPU6和过表达SIRT1蛋白表达的pcDNA3.1-SIRT1质粒转染入BEAS-2B细胞中，利用蛋白质免疫印迹实验检测下调和上调SIRT1蛋白的水平;利用细胞伤口愈合实验和Transwell实验检测8μM B[a]P暴露环境中，转染细胞迁移和侵袭速率的改变。　　4.B[a]P暴露下，SIRT1对TNF-α表达水平的影响:　　研究利用蛋白质免疫印迹实验检测8μM B[a]P暴露环境中，SIRT1重组质粒稳定转染细胞中NF-κB和COX-2的表达水平;利用流式细胞术检测8μMB[a]P暴露环境中，SIRT1重组质粒稳定转染细胞中TNF-α的表达水平;采用RT-PCR和双荧光素酶报告基因实验分别检测8μM B[a]P暴露下，TNF-α mRNA和启动子活性的变化。　　5.TNF-α在SIRT1调控细胞迁移和侵袭过程中发挥的作用:　　研究利用RT-PCR实验，检测TNF-α相关重组质粒的转染效率:利用细胞伤口愈合实验和Transwell实验检测8μM B[a]P暴露环境中，转染细胞迁移和侵袭速率的改变。　　6.TNF-α和Wnt/β-catenin信号通路之间的相互关系:　　研究利用RT-PCR筛选B[a]P暴露下，在SIRT1调控细胞迁移和侵袭过程中发挥作用的调控因子;将SIRT1过表达及其对照细胞暴露于8μM B[a]P环境下不同时间点后，利用RT-PCR实验检测β-catenin mRNA的表达水平;SIRT1重组质粒稳定转染细胞暴露于8μM B[a]P48 h后，利用细胞核和细胞浆蛋白抽提试剂盒提取出细胞核和细胞浆蛋白后，利用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin蛋白质的表达水平。分别利用Wnt/β-catenin特异性抑制剂XAV939和TNF-β敲低质粒作用于细胞后，检测8μM B[a]P暴露不同时间点后，TNF-α和β-catenin之间的相互作用。BEAS-2B细胞暴露于8μM B[a]P不同时间点后，利用细胞膜和细胞浆蛋白抽提试剂盒提取出细胞膜蛋白后，利用蛋白质免疫印迹实验检测E-cadherin蛋白质的表达水平。　　7.长期B[a]P暴露下，SIRT1对BEAS-2B细胞成瘤性的影响:　　利用裸鼠成瘤实验，验证长期B[a]P暴露下，SIRT1对BEAS-2B细胞成瘤数量和成瘤大小的影响。利用HE染色检测成瘤组织的病理学改变，利用免疫组织化学技术检测SIRT1、TNF-α、NF-κB和β-catenin等蛋白质的表达水平。　　结果:　　1.SIRT1在人肺癌组织中高表达:　　免疫组织化学实验结果表明SIRT1蛋白在肺恶性肿瘤组织，包括腺癌和鳞癌中的表达量显著高于肺正常组织（（80.48±23.63）×104 vs.（78.86±26.59）×104vs.（1.02±1.95）×104），差异具有统计学意义。　　2.B[a]P暴露下，BEAS-2B细胞和小鼠肺部组织中SIRT1的表达:　　RT-PCR结果表明B[a]P暴露下，SIRT1 mRNA的表达水平逐步升高，且具有时间依赖性。与mRNA结果相一致，蛋白质免疫印迹实验表明B[a]P对SIRT1蛋白的诱导具有时间依赖性，且SIRT1蛋白表达量在48 h达到峰值;利用免疫组织化学实验技术，发现支气管灌注B[a]P小鼠的肺部组织中SIRT1的表达量明显高于对照组(0 d vs.30 d vs.60 d vs.90 d vs.120 d vs.150 d vs.180 d=1 vs.46.76 vs.40.47 vs.81.01 vs.164.08 vs.289.66 vs.544.29)，结果具有统计学意义。炎症相关细胞因子NF-κB和TNF-α表达量显著升高。同时，COX-2表达水平略有升高;免疫组织化学实验技术结果表明TNF-α、NF-κB和COX-2在人肺腺癌和鳞癌中的表达量明显高于正常组织。　　3.B[a]P暴露下，SIRT1促进BEAS-2B细胞的迁移和侵袭:　　蛋白质免疫印迹实验证明SIRT1相关质粒转染效率高;利用细胞伤口愈合实验和Transwell实验证明8μM B[a]P暴露环境中，过表达SIRT1能够促进BEAS-2B细胞迁移和侵袭，反之亦然。　　4.B[a]P暴露下，SIRT1促进TNF-α的表达:　　蛋白质免疫印迹实验表明过表达SIRT1能够促进BEAS-2B细胞中NF-κB和COX-2蛋白的表达。同时，抑制SIRT1能够降低NF-κB和COX-2的表达;流式细胞术结果发现过表达SIRT1能够促进BEAS-2B细胞中TNF-α蛋白的表达。同时，抑制SIRT1能够降低TNF-α的表达;RT-PCR实验表明过表达SIRT1能够促进BEAS-2B细胞中TNF-α mRNA的表达;双荧光素酶报告基因实验结果表明SIRT1过表达能够提高TNF-α启动子的转录活性。　　5.TNF-α作为SIRT1下游信号分子，参与SIRT1调控细胞迁移和侵袭的过程:　　RT-PCR实验证明TNF-α相关质粒转染效率高;利用细胞伤口愈合实验和Transwell实验证明8μM B[a]P暴露环境中，过表达TNF-α能够促进BEAS-2B细胞迁移和侵袭，反之亦然。　　6.TNF-α和Wnt/β-catenin信号通路之间互相调控:　　RT-PCR实验结果表明SIRT1表达量与β-catenin呈正相关;研究利用细胞核和细胞浆蛋白抽提试剂盒，证明SIRT1可以增加β-catenin在细胞核内的积聚。分别利用Wnt/β-catenin特异性抑制剂XAV939和TNF-α敲低质粒作用于细胞后，发现B[a]P暴露下，BEAS-2B细胞中TNF-α和Wnt/β-catenin通路之间存在相互促进的关系。研究利用细胞膜和细胞浆抽提试剂盒，表明B[a]P暴露下，BEAS-2B细胞膜蛋白中E-cadherin的蛋白表达量明显降低。　　7.长期B[a]P暴露下，SIRT1能够诱导BEAS-2B细胞肿瘤形成:　　裸鼠成瘤实验结果表明，相对于对照组细胞，长期暴露于B[a]P的SIRT1过表达细胞形成的肿瘤体积明显较大。同时，利用免疫组织化学技术表明在SIRT1过表达细胞形成的肿瘤组织中，TNF-α和β-catenin表达量明显高于对照组。　　结论:　　研究结果显示B[a]P能够诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B中SIRT1的表达。同时，SIRT1在人肺组织标本和B[a]P暴露的小鼠肺部组织标本中均高表达。研究结果进一步证实B[a]P暴露下，过表达SIRT1能够促进TNF-α和β-catenin的表达，抑制E-cadherin在细胞膜表面的积聚。以上结果阐述了TNF-α和β-catenin之间的相互作用。除此之外，B[a]P暴露下，SIRT1能够促进BEAS-2B细胞的迁移/侵袭以及诱发裸鼠体内的肿瘤生成。因此，实验阐明了B[a]P暴露下，SIRT1通过TNF-α/β-catenin通路，诱导慢性炎症致肺癌发生发展的分子机制。