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第一部分结直肠癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群初步研究目的:检测不同结直肠癌细胞系中存在肿瘤干细胞样亚群,探讨初步富集肿瘤干细胞相关亚群的方法。方法:采用流式细胞术检测结直肠癌细胞系LOVO、SW480、HCT116中的SP(Side Population)细胞,添加生长因子的无血清培养基(SFM)培养SW480初步分离,富集肿瘤干细胞样亚群,有限稀释实验,诱导分化,传代更新,含血清/无血清培养基交替培养证实肿瘤干细胞相关亚群的存在。结果:LOVO、SW480、HCT116细胞系中含SP细胞分别为1.0%,1.2%和1.3%;SW480细胞中约含有0.54%~0.62%的细胞能够在无血清培养基中能够存活、增殖,形成悬浮的肿瘤细胞球;在SFM中加入血清可促使肿瘤干细胞相关细胞分化;肿瘤干细胞相关细胞可以连续传代,并可交替培养于含10%小牛血清培养基(SSM)和SFM中。结论:结直肠癌细胞系LOVO、SW480、HCT116中含SP细胞,SW480中的肿瘤干细胞相关亚群可通过无血清培养基初步富集。第二部分LOVO细胞系中结肠癌肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定目的:从LOVO细胞系中分离、鉴定具有CD44+/EPCAMhigh特异表型的结肠癌肿瘤干细胞,观察其生物学行为,证实细胞系中肿瘤干细胞的存在。方法:从普通血清培养的LOVO细胞系中,以流式细胞仪检测,分离具有CD44+/EPCAMhigh表型的结肠癌肿瘤干细胞,并接种于添加生长因子的无血清培养基中,观察其生长增殖过程,继而诱导分化;MTT法,流式细胞技术分别检测细胞克隆增殖能力,凋亡及细胞周期分布;最后接种裸鼠,比较细胞的成瘤率,并用免疫荧光技术观察次代肿瘤CD44/EPCAM的表达。结果:LOVO细胞系中有17.4%的CD44+/EPCAMhigh表型细胞,并能在添加生长因子的无血清培养基中呈细胞球样生长,连续传代,在血清的诱导下分化呈贴壁生长与未分选LOVO细胞无差别;CD44+/EPCAMhigh细胞组(PG)较EPCAMlow细胞组(NG)及未分选细胞组(CG)更强的增殖能力,细胞周期多集中在G0/G1期;以500个CD44+/EPCAMhigh细胞接种裸鼠成瘤率为90%(9/10),而104个EPCAMlow细胞成瘤率为0(0/10);次代肿瘤细胞在荧光显微镜下观察仍有少量细胞表达CD44/EPCAM。结论:LOVO细胞株中存在CD44+/EPCAMhigh表型的结肠癌肿瘤干细胞,在无血清培养基中能稳定传代,可诱导分化,为肿瘤干细胞的研究提供了可靠细胞来源。