RAPD标记技术及rDNA ITS序列分析对蒲公英的应用研究

来源 :河南中医学院 河南中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaoyawxh
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目的:研究河南蒲公英属植物的亲缘关系与遗传多样性,为蒲公英属植物的品种鉴别、分类、优良品种的选育及其品质评价提供分子依据。  方法:(1)分别采用改良的CTAB、SDS、高盐低pH三种提取方法及液氮、玻璃砂两种研磨方法提取蒲公英基因组总DNA,通过紫外吸收、电泳检测和PCR扩增检测所得DNA的纯度和浓度。(2)以提取出的基因组总DNA为模板,对蒲公英RAPD-PCR反应体系中各个主要的影响因子进行优化和筛选。(3)利用RAPD分子标记技术和方法对不同居群蒲公英进行检测,通过计算遗传相似系数并建立其聚类分析图。(4)提取不同产地的蒲公英基因组总DNA,以核糖体基因组ITS通用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。  结果:(1)不同提取方法所得到得DNA纯度和浓度存在显著差异,以改良的CTAB法提取效果最好,纯度最高,电泳结果显示主条带最清晰,降解较少。两种研磨方法所得结果相近。(2)建立了多态性高、重复性好,可用于蒲公英RAPD分析的最佳反应体系。25μl反应体系中含有:1×TaqMixbuffer、50ngDNA模板、0.4μmol/L引物、1.5mmol/LMg2+、0.25mmol/LdNTPs、1.25UTaq酶。扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,38℃复性1min,72℃延伸2min,共40个循环;72℃延伸10min,反应结束后,4℃保存。(3)从150条随机引物筛选出10条有效引物,在河南4个品种24个野生蒲公英居群RAPD共扩增出1110个位点,平均每个引物扩增出111个位点,每个居群扩增出46.25个位点;在所获得的95条可重现谱带中,7条单态,88条多态,多态性程度达92.63%,遗传距离在0.0087-0.7922。(4)蒲公英属植物ITS序列总长度约为641-642bp,其中ITS1长度为255-256bp,5.8S长度为162bp,ITS2长度为224bp。序列间共有23个变异位点。运用DNAStar软件进行系统分析得到蒲公英属内4种植物的系统进化树,这一分析结果与来自形态学的研究结果基本吻合。  结论:(1)改良的CTAB法适合于蒲公英基因组总DNA的提取。(2)优化出的PCR反应体系为今后利用RAPD分子标记技术进行蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础。(3)蒲公英不同种、同一种不同居群间存在明显的遗传分化,其中种间差异大于种内,遗传多样性主要存在于居群间;RAPD技术可以作为蒲公英居群遗传多态性、亲缘关系及品种鉴别研究的有效手段。(4)rDNAITS序列分析可用于蒲公英属植物种间及真伪品鉴别。
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